[发明专利]通过指导的内切核酸酶和单链寡核苷酸进行基因组编辑

权利要求书

1.一种用于使用多核苷酸指导的内切核酸酶在微生物细胞基因组中的至少一个靶序列中引入一个或多个所需核苷酸修饰的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供微生物宿主细胞，该微生物宿主细胞包含位于该多核苷酸指导的内切核酸酶的原型间隔子相邻基序(PAM)序列附近的至少一个待修饰的基因组靶序列；

b)用以下转化该微生物宿主细胞：

i)该多核苷酸指导的内切核酸酶和用于该至少一个待修饰的靶序列的至少一种合适的指导多核苷酸，或者编码该多核苷酸指导的内切核酸酶和编码用于该至少一个待修饰的靶序列的至少一种合适的指导多核苷酸的一种或多种多核苷酸，和

ii)能够与该至少一个基因组靶序列杂交的至少一种单链或双链寡核苷酸，所述寡核苷酸包含该一个或多个所需核苷酸修饰；

其中该多核苷酸指导的内切核酸酶与该指导多核苷酸和基因组中的原型间隔子互补序列相互作用并且切割或切开基因组，并且其中该至少一种单链或双链寡核苷酸指导DNA修复穿过该切口或缺口，从而以至少以下的效率将该一个或多个所需修饰引入基因组的该靶序列中：

当该切口或缺口位于距该一个或多个所需核苷酸修饰10-20个核苷酸时为70％、优选至少80％，

当该切口或缺口位于距该一个或多个所需核苷酸修饰21-30个核苷酸时为60％，

当该切口或缺口位于距该一个或多个所需核苷酸修饰31-43个核苷酸时为50％，

当该切口或缺口位于距该一个或多个所需核苷酸修饰44-52个核苷酸时为40％，或者

当该切口或缺口位于距该一个或多个所需核苷酸修饰至少53个核苷酸时为30％。

2.如权利要求1所述的方法，其中该微生物宿主细胞是原核生物或真核生物。

3.如权利要求2所述的方法，其中该微生物宿主细胞是原核生物，优选地该宿主细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌；更优选地，该宿主细胞是选自以下属的革兰氏阳性细菌：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链球菌属；甚至更优选地，该宿主细胞是芽孢杆菌属细胞；并且最优选地，该宿主细胞选自以下物种：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

4.如权利要求2所述的方法，其中该微生物宿主细胞是丝状真菌细胞；更优选地，该宿主细胞是选自以下属的丝状真菌宿主细胞：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢霉属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；并且最优选地，该宿主细胞是选自以下物种的丝状真菌宿主细胞：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢霉、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳、长绒毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉和绿色木霉。

5.如权利要求4所述的方法，其中该微生物宿主细胞包含灭活的非同源末端连接(NHEJ)系统；优选地，该细胞包含灭活的DNA连接酶D(LigD)和/或DNA末端结合蛋白Ku或其一种或多种同源物；甚至更优选地，该细胞包含灭活的ligD、ku70和/或ku80基因或其一种或多种同源物。