[发明专利]用于制造包含人干细胞衍生的肺泡巨噬细胞的三维肺类器官的方法

权利要求书

1.一种用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使干细胞分化为包含定型内胚层(DE)细胞和中胚层细胞；

2)在二维培养瓶中培养步骤1)的所述定型内胚层细胞和中胚层细胞以分化为前部前肠内胚层(AFE)细胞；

3)在二维培养瓶中培养步骤2)的所述AFE细胞；和

4)在三维培养瓶中培养步骤3)的所述培养的细胞。

2.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述干细胞为胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或成人干细胞。

3.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中以总细胞的50％至90％的比例包含步骤1)的所述定型内胚层细胞。

4.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中以总细胞的50％至80％的比例包含步骤1)的所述定型内胚层细胞。

5.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中以总细胞的70％至80％的比例包含步骤1)的所述定型内胚层细胞。

6.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中在前化培养基上进行步骤2)的培养。

7.根据权利要求6所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述前化培养基含有TGF-β(转化生长因子β)信号传导通路抑制剂和Wnt信号传导通路抑制剂。

8.根据权利要求7所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述TGF-β信号传导通路抑制剂为SB431542或Noggin。

9.根据权利要求7所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述Wnt信号传导通路抑制剂为IWP-2、IWP-3或IWP-4。

10.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中在含有人工基膜的LO(肺类器官形成)培养基中进行步骤3)的培养。

11.根据权利要求10所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述LO培养基含有GSK-3β(糖原合酶激酶3β)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)、肺分支型增殖抑制剂和肺泡再生激活剂。

12.根据权利要求11所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021。

13.根据权利要求11所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述成纤维细胞生长因子为FGF10和FGF7/KGF。

14.根据权利要求11所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述肺分支型增殖抑制剂为骨形态发生蛋白(BMP)。

15.根据权利要求11所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中所述肺泡再生激活剂为全反式维甲酸。

16.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中在不含人工基膜的LO(肺类器官形成)培养基中进行步骤4)的培养。

17.根据权利要求1所述的用于制造包含肺泡巨噬细胞的肺类器官的方法，其中从分化的第15天至第25天开始进行步骤4)的所述三维培养。

18.一种通过权利要求1至17中任一项所述的用于制造肺类器官的方法制备的包含肺泡巨噬细胞的肺类器官。