[发明专利]用于测量复制缺陷型病毒载体和病毒的感染性的方法

说明书

本文提供了用于测量复制缺陷型病毒和病毒载体的感染性的改进的方法。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒是重组AAV。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月15日提交的美国临时申请号62/745,859的优先权，所述临时申请整体并入本文。

背景技术

基于重组腺相关病毒(AAV)的载体目前是开发中使用最广泛的基因疗法产物。rAAV载体系统的优选使用部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、AAV转导非分裂细胞和分裂细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。此外，不同的天然存在和重组rAAV载体血清型特异性地靶向不同的组织、器官和细胞，并帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫，从而扩大基于AAV的基因疗法的治疗性应用。

在基于复制缺陷型病毒(例如AAV)的基因疗法可更广泛地用于临床后期和商业用途之前，需要开发用于大规模生产重组病毒颗粒的新方法。通过有限稀释终点分析(也称为TCID50感染滴度测定)对感染滴度进行绝对定量已成为用于体外测量重组病毒(例如AAV)制剂感染性的标准方法。虽然TCID50感染滴度测定已可用于确认AAV载体制剂具有感染性，但其较大的测定变异性(高达200％的几何变异系数)限制了其在支持产物一致性、可比性和稳定性方面的适用性。因此，需要更准确的方法来测量包含复制缺陷型病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的组合物的感染性。

发明内容

本公开提供了用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，其中所述方法包括：在允许所述病毒颗粒对靶细胞进行接种的条件下，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物接触；去除细胞外病毒颗粒；分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液接触。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液小于十倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应是数字聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述AAV是重组AAV(rAAV)。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。