[发明专利]利用成像细胞计数术的病毒中和测定法

说明书

本发明描述了病毒减少中和测试(VRNT)，其为当前标准的低通量和费力的中和测定法的快速、高通量替代方案。VRNT利用成像细胞计数法在感染后约一天对病毒‑感染的细胞进行计数(因此消除了其他测定法采用的允许病毒感染从细胞至细胞的等待时间)，减少总体测定时间，并将通量增加至少15倍。

发明背景

登革热(DEN)是一种黄病毒科(黄病毒属)的蚊子传播的正义RNA病毒，其具有四种不同的血清型(DEN 1-4)。登革热影响超过40%的世界人口，并且是世界的亚热带和热带地区中幼儿中的疾病和死亡的主要原因(WHO. Dengue Fact Sheet (2007))。随后登革热病毒毒株的感染是严重疾病的危险因素，并且与90%的登革出血热(DHF)病例有关，而原发感染后呈现DHF的剩余10%主要是生命的第一年内的儿童(Green, S.和Rothman A., Curr. Opin. Infect. Dis. (2006) 19:429-36)。高流行区域传播所有四种血清型。因此，登革热的疫苗应当是四价的，提供均衡的免疫应答(WHO. Geneva, 2013)，并保护幼儿。一种疫苗(Dengvaxia® (CYD-TDV))目前在几个流行国家中被许可用于9-45岁的个体，其中年龄依赖性疫苗效力为45-66% (Hadinegoro, S.R. 等人, N. Engl. J. Med. (2015) 373:1195-1206; Godoi, I. P. 等人, J. Comp. Eff. Res. (2017) 6:165-180)。该疫苗由于在幼稚(naïve)受试者中缺乏效力而在幼儿(9岁)中禁忌使用，并且得到III期试验中接种疫苗的2-5岁儿童中住院增加的支持。世界卫生组织(WHO)设定了到2020年全世界登革热疾病减少25%和死亡减少50%的目标(WHO Press, Geneva, 2012)；因此，迫切需要一种改进的登革热疫苗，尤其是在较年幼儿童中有效的登革热疫苗。

疫苗引发免疫应答的能力对于疫苗开发至关重要，并且在确定临床效力中是重要的。血清抗体应答的量度是评价免疫原性的优选方法。具体地，功能性中和抗体测试是经常进行以检测可有效中和病毒、预防体外感染的抗体量的血清学测定法。一种测量登革热病毒中和的技术是使用用悬浮细胞的流式细胞计数术，并且需要在固定和染色过程中的额外步骤(de Silva等人, J. Clin. Microbiology, (2007) 45:3777-3780)。当前用于测量病毒中和(包括登革热病毒中和)的金标准测试是噬斑减少中和测试(PRNT)，或类似的病灶减少中和测试(FRNT)，其利用免疫染色来将感染后的“噬斑”(称为病灶)可视化(当病毒感染和进一步复制从细胞扩散至细胞时生成噬斑)。由于病毒感染速率慢，这些测试是非常耗时的。例如，一些病毒可能花费数天(最多达5天或更多天)来经由噬斑或病灶形成显示可检测的感染。24-孔板形式已用于登革热临床样品FRNT测试(Durbin, A. P. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (2001) 65:405-413; Timiryasova, T. M. 等人, Am. J. Trop. Med. Hyg. (2013) 88:962-970)，对于2倍稀释方案，其每板仅容纳一个一式两份样品。当前开发中的登革热疫苗是四价的(Torresi, J. 等人, Hum. Vaccin. Immunother. (2017) 13:1059-1072)，由此使每个样品的测试数增加4倍。对于包括数千个参与者的大型研究，所需的板的数量变得累赘，并且测试加上分析的时间冗长，因此，涵盖接种疫苗的受试者的亚组的随机免疫原性组经常代替完整的样品测试(Saez-Llorens, X. 等人, Lancet Infect. Dis. (2017) 17:615-625; L’Azou, M. 等人, N. Engl. J. Med. (2016) 374:1155-1166)。因此，迫切需要改进当前的测试方法以减少测定时间并增加通量。本文描述了病毒减少中和测试(VRNT)。