[发明专利]前端具有纳米结构的电极

说明书

本发明的目的在于提供用于通过不需要磁力、对细胞的侵入性小且简便的方法形成细胞的细胞内记录电极的方法，所述方法还能够准确地进行短期或长期的细胞内电位测定。具体而言，本发明提供了一种方法，该方法将设置在前端具有导电性纳米结构的导电体上的保持件固定在操纵器等上，在调节对目标细胞的加压程度的同时使前端纳米结构部分贯通细胞膜，在细胞上方形成自立固定的细胞内记录电极，并测定细胞内电位。前端的导电性纳米结构和导电体主体可以不具有磁性、可以被一体化、也可以通过磁力而吸附。此外，在由磁铁电极(Magele)形成导电体主体、记录在通常的培养容器中培养的目标细胞的细胞膜电位的情况下，通过在培养容器下面使用能够在中央确保光投射用或光观察用路径的环型磁铁自立固定，在目标细胞的细胞内电位测定的同时，还能够进行光刺激引起的细胞内电位的变化或细胞内钙动力学等的荧光观察。

技术领域

本发明涉及使用前端具有纳米结构的电极来测定和/或控制细胞内电位或电位变化的方法及用于该方法的电极。

背景技术

所有细胞在细胞内和细胞外具有不同的离子组成，通过保持其离子分布差异及其离子组成差异的转运蛋白(例如钠泵)来保持细胞内电位(膜电位)。在静息状态下，膜电位虽稳定(静息膜电位)，但由于膜表面的离子通道被活化并打开，因膜内外的离子浓度差，离子一下子放出或流入，整个细胞内的电位发生变化(发生去极化或超极化)，导致细胞内电位发生变化。其结果是，在心肌和神经中引起动作电位的产生/传递，引起激素和神经递质的释放等信息传递，在心肌、骨骼肌细胞中引起收缩。

一直以来，通过测定细胞的膜电位变动、与此相伴的通过离子通道的膜电流，可对细胞的状态变化和细胞对药物等的响应进行观察。特别是在药物发现筛选(創薬スクリーニング)时，将培养的心肌细胞、神经细胞等暴露于药物发现候选药物，测定膜电位的变化而对心脏毒性、神经毒性等进行评价正在广泛进行。

为了测定细胞内电位，以往在细胞内插入金属制电极或充满电解液的微玻璃电极，测定与细胞外的电极的电流或电压。最近，建立了基于膜片钳(Patch Clamp)法的测定法，并已成为主流。膜片钳法是指通过使充满细胞内电解液的玻璃移液管(ピペット)和细胞膜紧密贴附，使玻璃移液管和细胞电一体化，精确测定、控制细胞内电位变化的方法。

膜片钳法包括测定在整个细胞中表达的离子通道的动态的全细胞模式；测定仅在膜片移液管内径内的细胞膜中含有的离子通道的动态(单通道活性)的方法(细胞贴附(oncell)模式)；还有从细胞中分离出其微细胞膜进行测定的方法(内膜片(inside patch)、外膜片(outside patch)模式)。

在全细胞模式中，通过刺破与玻璃移液管贴附的电极的内径上的细胞膜，测定细胞内电位变化、通过整个细胞中的离子通道的电流(离子通道的活性)的动态。由于上述技术是在显微镜下对单个细胞直接使用电极进行的记录法，因此需要高度熟练的技术以及较高的专业知识。

这些细胞内记录法(电压钳、电流钳)以膜片钳法(全细胞膜片)为代表，能够观察通过细胞膜中表达(存在)的离子通道的离子的动态。在电压钳模式中，通过包含在膜片钳放大器(増幅器)中的反馈功能可以有效地控制细胞内的电位，并且可以将由离子通道开闭引起的快速(以毫秒为单位的)现象记录为离子电流变化。在电流钳模式中，可以将因离子通道的活动对细胞的作用记录为(膜)电位变化。

膜片钳方法中包括手动(手动式)膜片钳法和自动膜片钳法，手动膜片钳法在电生理学测定中的数据可靠性高。然而，由于操作人员使用显微镜、操作操纵器(マニピュレーター)进行实验等的手法复杂且需要丰富的专业知识，因此效率非常差。这在医学生物学研究，特别是在药物发现领域中已经成为一大障碍。

另一方面，自动膜片钳法是自动化的电生理学测定仪器，近年来虽然性能显著提高，但在数据可靠性方面，还没有获得能够取代手动膜片钳法的程度的可靠性。此外，由于自动膜片钳试验仪器非常昂贵，其使用仅限于一些大制药企业。