[发明专利]低免疫原性的工程化人类间充质基质细胞，制备方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于制备减弱的免疫原性的人类间充质基质细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)突变人类多能干细胞β2-微球蛋白基因的两个等位基因；

(b)将所述突变的人类多能干细胞分化成在β2-微球蛋白基因上具有双等位基因突变的衍生的人类间充质基质细胞；

其中，所述衍生的人类间充质基质细胞不表达β2-微球蛋白且表达减弱的或不表达位于细胞表面的HLA-I类分子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人类多能干细胞是人类胚胎干细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人类多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞来源于外周血细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括确定突变存在于β2-微球蛋白基因的两个等位基因中。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述β2-微球蛋白基因上具有双等位基因突变的所述衍生的人类间充质基质细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166或其组合的至少一种，并且包括低表达或不表达CD14、CD34、HLA-DR、CD25、CD45、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C或其组合的任何一种。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述等位基因由一个或多个质粒突变，所述质粒包括一条靶向β2-微球蛋白基因部分的向导核酸序列和一个核酸内切酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述核酸内切酶包括一条与成簇规律间隔短回文重复序列关联的核酸序列Cas9。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述靶向β2-微球蛋白基因部分的所述向导核酸序列包括一条选自SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的序列。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述人类多能干细胞通过以下方法突变：

i.用第一质粒转染所述人类多能干细胞，以突变β2-微球蛋白基因的第一等位基因，所述质粒包括一个核酸内切酶、靶向β2-微球蛋白基因部分的向导核酸序列和至少一个选择标记物；

ii.通过所述至少一个选择标记物选择在β2-微球蛋白基因的第一等位基因中具有突变的细胞；

iii.用第二质粒转染在β2-微球蛋白基因的第一等位基因中具有突变的细胞，以突变β2-微球蛋白基因的第二等位基因，所述质粒包括一个核酸内切酶、靶向β2-微球蛋白基因部分的向导核酸序列和至少一个其他选择标记物；

iv.通过所述至少一个其他选择标记物，选择在β2-微球蛋白基因的第一等位基因中具有突变和在β2-微球蛋白基因的第二等位基因中具有突变的细胞。

11.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，将所述人类多能干细胞用一个质粒转染，以突变β2-微球蛋白基因的两个等位基因，所述质粒包括一个核酸内切酶、靶向β2-微球蛋白基因部分的向导核酸序列和一个选择标记物；通过所述选择标记物，选择在β2-微球蛋白基因的两个等位基因中具有突变的细胞。

12.经基因修饰的人类间充质基质细胞，包括不表达β2-微球蛋白且表达减弱的或不表达位于细胞表面的HLA-I类分子的细胞。

13.如权利要求12所述的细胞，其特征在于，表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166或其组合的至少一种，并且包括低表达或不表达CD14、CD34、HLA-DR、CD25、CD45、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C或其组合的任何一种。