[发明专利]羊水细胞来源的细胞外基质及其用途

说明书

公开了一种在体外衍生于从羊水分离的细胞的细胞来源的细胞外基质(ECM)，及其使用方法以用于包括干细胞在内的粘附细胞的分离、维持和增殖，以及用于干细胞的分化。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月3日提交的美国临时专利申请号62/740,817的权益，其通过引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明一般性地涉及细胞来源的细胞外基质及其用途，包括哺乳动物细胞的分离、维持和增殖以及干细胞的分化。

背景技术

体外细胞培养可能是所有细胞生物学以及再生医学和组织工程学发展领域中最普遍、最重要和最缺乏了解的方面。首先，它允许观察细胞行为，以便可以详细研究细胞功能的各个方面。其次，它允许增加特定细胞组群的数量。对于基础研究以及许多临床应用而言，需要从小的生物样品中获得大量相对稀有的细胞。体外细胞培养可使少量的细胞在体外扩增，以获得相对较多的数量。最后，它允许储存细胞以备后用。通过体外扩大细胞数量，并冷冻活细胞以备后用，相对较小的生物样品可以在数天、数月甚至数年的时间内产生用于多次实验的细胞。

尽管细胞培养普遍存在，但体外培养对细胞天然特性的影响仍知之甚少。我们当前的许多实践并非来自经过深思熟虑的想法、计划和实验，而是来自偶然的观察。哺乳动物细胞培养始于1900年代初，1911年，Alexis Carrel和Montrose Burrows首次发表了有关体外培养哺乳动物组织的学术论文。当时他们正在通过切割哺乳动物组织的切片并将它们放在显微镜载玻片上来研究组织的生理学和解剖学。然后，他们注意到一些细胞从组织中迁移出来到了载玻片上。他们继续描述了永久性地培养细胞的技术。现在看来，他们的某些观察可能无效，但他们的工作为现代细胞培养铺平了道路。

发现造血干细胞(HSC)之后，世界各地的研究小组都在研究(HSC)。在培养过程中(悬浮状态)，观察到骨髓细胞亚群粘附在塑料瓶的底部并开始增殖。这些细胞后来被认为与HSC不同，最终被称为间充质干细胞(MSC)。由于这种偶然的观察导致了MSC的发现，塑料粘附仍然被广泛用作MSC和许多其他哺乳动物细胞类型的最典型的属性。

在塑料基底上培养细胞的做法是有问题的，因为有大量的、现已在文献中被广泛接受的证据证明了微环境在调节细胞功能中的关键作用。已经证明微环境有助于指导干细胞和祖细胞的分化，并调节成熟细胞类型的行为。

当将细胞从其天然环境中移出并进行体外扩增时，它们会失去来自其周围的细胞外基质或微环境的重要的线索，这些线索会将有关其周围环境的组成和状态的重要信息传递给细胞。细胞微环境的变化对这些细胞的行为产生了深远的影响。目前体外分离和扩增大多数粘附细胞的标准是将细胞放置在由聚苯乙烯(塑料)组成的培养容器中。可以以某种方式处理聚苯乙烯以促进细胞附着和生长，但是在大多数情况下，表面对于细胞而言完全是外来的。在其他情况下，表面可以涂有单独的基质蛋白(例如纤连蛋白或胶原蛋白)或蛋白的某种组合。这些简单的基底忽略了天然微环境的复杂性以及微环境在正常细胞功能中的关键作用。细胞会立即以与所述细胞在其天然环境中时大不相同的方式响应于该外来环境。

目前采用了五种主要方法来解决在塑料基底上培养细胞的这一问题：

1.忽略所述问题–代替试图实现与体内期望的功能相匹配的需要的功能，可以在多种培养基中测试多种细胞类型，以找到在没有合适的基质基底的情况下表现出特定所需功能的细胞。这种方法并不复杂，而且由于变量之间的复杂相互作用以及细胞与细胞外基质之间相互作用的广度，通常无法产生预期的结果。

2.确定关键组件。–许多学术实验室和几家公司已经采取了考虑从中分离出细胞的组织并寻找该组织中可能对细胞功能重要的独特成分的方法。然后将细胞在仅由一种或几种基质成分所组成的简单基底上培养。这种方法通常会失败，因为基质是天然非常复杂的环境，在某些情况下包括一百多种不同的蛋白质。细胞对它们需要但接收不到的信号的反应和对它们不需要但能够接收到的信号的反应一样强烈。