[发明专利]通过核酸内切酶保护的靶向富集

权利要求书

1.一种从包含核酸分子的样品富集靶核酸片段的方法，其中靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二gRNA-CAS复合物切割所述核酸分子，从而产生包含感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段，所述靶核酸片段受到保护免于核酸外切酶切割；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；和

d)任选地，从步骤c)所得的消化物纯化包含感兴趣的序列的靶核酸片段。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤c)的核酸外切酶消化前，所述方法不包括保护所述靶核酸片段或所述靶核酸片段的末端的进一步的步骤。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中满足以下至少之一：

i)步骤b)如下实施：将所述第一和第二gRNA-CAS复合物与核酸分子一起在约10-90℃、优选约37℃温育约1分钟-约18小时，优选约60分钟；和

ii)步骤c)如下实施：将经切割核酸分子与核酸外切酶在约10-90℃、优选约37℃温育约1分钟-约12小时，优选30分钟。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二gRNA-CAS复合物至少之一包含Cas9蛋白。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二gRNA-CAS复合物至少之一包含sgRNA。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二gRNA-CAS复合物至少之一包含作为不同分子的crRNA及tracrRNA。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二gRNA-CAS复合物至少之一能够诱导DSB。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二gRNA-CAS复合物都能够诱导DSB。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述步骤b)中，第一和第二gRNA-CAS复合物至少之一使核酸分子的一条链产生缺口，且其中核酸分子与至少第三gRNA-CAS复合物接触，所述第三gRNA-CAS复合物使互补链在所述第一或第二gRNA-CAS复合物所形成的缺口的位置的基本互补的位置产生缺口。

10.从包含核酸分子的样品中制备接头连接的靶核酸片段的方法，其中所述靶核酸片段包含感兴趣的序列，且其中所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述核酸分子的样品，其中所述核酸分子包含所述感兴趣的序列；

b)用至少第一和第二gRNA-CAS复合物切割所述核酸分子，从而产生包含感兴趣的序列的靶核酸片段和至少一个非靶核酸片段；

c)使步骤b)所得的经切割的核酸分子接触核酸外切酶并允许所述核酸外切酶消化所述至少一个非靶核酸片段；

d)任选地，从步骤c所得消化物纯化包含感兴趣的序列的靶核酸片段；和

e)使接头与靶核酸片段连接。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述接头是序列接头。