[发明专利]使用无抗生素选择在未灭菌条件下生长的基因工程蓝细菌

权利要求书

1.一种分离的基因工程蓝细菌，其中，所述蓝细菌已被至少一个多核苷酸分子转化；所述至少一个多核苷酸分子包括与至少一个启动子可操作地连接的异源三聚氰胺利用途径基因atzD、trzE、DUR1,2、trzC、guaD和triA，其中；

i)所述triA基因包括编码氨基酸取代的一个或多个突变，其中，所述氨基酸取代位于选自包括以下的组的位置：Leu88Phe、His254Tyr、Glu317Lys、Ala355Val、Trp471Stop以及254His和Val278Met的组合；

和/或

ii)所述triA基因具有包括AGGAGA至AGAAGA突变的核糖体结合位点(RBS)，

其中，所述基因工程蓝细菌不具有异源抗生素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述triA基因编码选自包括以下的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。

3.根据权利要求2所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述triA基因包括选自包括以下的组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述异源基因trzE包括SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72中所示的多核苷酸序列；

trzC包括SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74中所示的多核苷酸序列；

DUR1,2包括SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76中所示的多核苷酸序列；

atzD包括SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78中所示的多核苷酸序列；

guaD包括SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:81(Arg352Ser)中所示的多核苷酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述三聚氰胺利用途径基因的每一种具有对于所述三聚氰胺利用途径基因的每一种的核糖体结合位点(RBS)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述至少一个启动子是组成型启动子。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述异源三聚氰胺利用途径基因从单个启动子表达，作为基因操纵子的一部分。

8.根据权利要求7所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述基因操纵子多核苷酸序列选自包括以下的组：SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87和SEQ ID NO:88。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述至少一个多核苷酸分子进一步包括：包括与启动子可操作地连接的异源亚磷酸盐脱氢酶(ptxD)基因的多核苷酸。

10.根据权利要求9所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述ptxD基因包括SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:91中所示的多核苷酸序列。

11.根据权利要求9或10所述的分离的基因工程蓝细菌，其中，所述异源亚磷酸盐脱氢酶(ptxD)基因从单个启动子表达，作为基因操纵子的一部分，其中，所述操纵子多核苷酸序列在SEQ ID NO:93中示出。