[发明专利]依靠人工反式激活物的选择

权利要求书

1.用于选择基因组编辑细胞和/或在细胞群体中富集基因组编辑细胞的方法，其包括：

(a)将至少一个第一组分、至少一个第二组分和至少一个第三组分引入细胞或细胞群体中；和

(b)选择瞬时表达或瞬时上调编码选择子的核苷酸序列的基因组编辑细胞；

其中所述第一组分是供体报告物盒，其包含所述编码选择子的核苷酸序列和感兴趣的核苷酸序列(NOI)，以及任选地与调节元件可操作连接的最小启动子；

其中所述第二组分是工程化转录反式激活物(ETT)多肽或编码ETT多肽的核苷酸序列；其中所述ETT多肽包含DNA结合域(DBD)和至少一个转录激活物(TA)域；

其中所述第三组分是核酸酶系统，所述核酸酶系统包含基因组靶向核酸酶和任选地引导RNA(gRNA)，所述引导RNA包含至少一个靶向基因组序列；

其中所述ETT多肽瞬时存在于所述细胞或细胞群体中，或者所述编码ETT多肽的核苷酸序列在所述细胞或细胞群体中瞬时表达；和

其中所述细胞或细胞群体中所述核酸酶系统的存在使得能够将所述编码选择子的核苷酸序列和所述NOI以及任选地与所述调节元件可操作连接的所述最小启动子插入靶基因座中，并且其中所述ETT多肽的瞬时存在或所述编码ETT多肽的核苷酸序列的瞬时表达使得能够瞬时表达或瞬时上调所述编码选择子的插入核苷酸序列，任选地当调节物存在于所述细胞或细胞群体中时或任选地当调节物不存在于所述细胞或细胞群体中时。

2.根据权利要求1的方法，其中所述供体报告物盒序贯包含：

(i)包含与靶基因座同源的核苷酸序列的左同源臂(HA)；

(ii)与最小启动子可操作连接的所述编码选择子的核苷酸序列；

(iii)与启动子可操作连接的所述NOI；和

(iv)包含与所述靶基因座同源的核苷酸序列的右同源臂(HA)；

其中当将所述编码选择子的核苷酸序列插入所述靶基因座时，所述第二组分的ETT多肽或由所述第二组分表达的ETT多肽激活所述最小启动子。

3.根据权利要求1的方法，其中所述供体报告物盒序贯包含：

(i)包含与靶基因座同源的核苷酸序列的左同源臂(HA)；

(ii)任选地，剪接受体位点(SA)；

(iii)所述NOI；

(iv)与最小启动子可操作连接的所述编码选择子的核苷酸序列；和

(v)包含与所述靶基因座同源的核苷酸序列的右同源臂(HA)；

其中当将所述编码选择子的核苷酸序列插入所述靶基因座时，所述第二组分的ETT多肽或由所述第二组分表达的ETT多肽激活所述最小启动子。

4.根据权利要求1的方法，其中所述供体报告物盒序贯包含：

(i)包含与靶基因座同源的核苷酸序列的左同源臂(HA)；

(ii)任选地，剪接受体位点(SA)；

(iii)所述NOI；

(iv)任选地，编码2A自切割肽(2A)或内部核糖体进入位点(IRES)元件的核苷酸序列；

(v)所述编码选择子的核苷酸序列，任选地，所述编码选择子的核苷酸序列与最小启动子可操作连接；和

(vi)包含与所述靶基因座同源的核苷酸序列的右同源臂(HA)；

其中所述第二组分的ETT多肽或由所述第二组分表达的ETT多肽激活所述靶基因座中的内源启动子。