[发明专利]生产3-岩藻糖基乳糖和转化乳糖的α-1,3-岩藻糖基转移酶

权利要求书

1.一种生产α-1,3-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的多肽，其中所述多肽包含：

i)编码保守的GDP-岩藻糖结合结构域[Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R](SEQID NO 33)的氨基酸序列；

ii)编码保守的[K/D][L/K/M]XXX[F/Y]结构域(SEQ ID NO 34)的氨基酸序列，和

iii)其中如果ii)的结构域等于DM[A/S]VSF(SEQ ID NO 36)，则另外地在N-末端区域存在保守的基序[N/H]XDPAXLD(SEQ ID NO 35)；

其中X可以是任何不同的氨基酸；和

其中所述多肽的C-末端具有从GDP-岩藻糖结合结构域的第一个氨基酸开始的小于或等于100个氨基酸；

b)在其中所述多肽催化岩藻糖残基从供体底物转移至受体底物的条件下，使步骤a)的具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽与包含GDP-岩藻糖作为供体底物和乳糖作为受体底物的混合物接触，

从而产生α-1,3-岩藻糖基乳糖，

c)任选地分离所述α-1,3-岩藻糖基乳糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽在无细胞系统中提供。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽由包含编码所述多肽的多核苷酸的细胞产生。

4.根据权利要求1或3中任一项所述的方法，其中所述GDP-岩藻糖和/或乳糖由产生所述GDP-岩藻糖和/或乳糖的细胞提供。

5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供经基因修饰以产生α-1,3-岩藻糖基乳糖的细胞，所述细胞包含至少一种编码用于α-1,3-岩藻糖基乳糖合成的酶的核酸序列，

所述细胞包含具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的所述多肽的表达，

ii)在允许产生α-1,3-岩藻糖基乳糖的条件下在培养基中培养细胞，

iii)优选地从培养中分离α-1,3-岩藻糖基乳糖。

6.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的所述多肽的宿主细胞；

b)在允许产生α-1,3-岩藻糖基乳糖并允许表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性的所述多肽的合适的营养条件下使所述宿主细胞生长；

c)在步骤b)的同时或之后提供供体底物GDP-岩藻糖和受体底物乳糖，以便α-1,3-岩藻糖基转移酶多肽催化岩藻糖残基从GDP-岩藻糖向乳糖的转移，从而产生α-1,3-岩藻糖基乳糖；

d)任选地从宿主细胞或其生长的培养基中分离所述α-1,3-岩藻糖基乳糖。

7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中宿主细胞经转化或转染以表达具有α-1,3-岩藻糖基转移酶活性和具有使用乳糖作为受体底物的能力的外源多肽。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于通过在宿主细胞中同时表达的酶或通过宿主细胞的代谢来提供GDP-岩藻糖和/或乳糖。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其进一步包括α-1,3-岩藻糖基乳糖的纯化。