[发明专利]用于生产造血谱系细胞的方法和系统

权利要求书

1.一种用于体外产生造血谱系细胞的方法，其包括：

(a)提供多个第一球体，其包含在第一培养基内的多能干细胞(PSC)，其中所述第一球体的直径达到约60-150微米，约70-120微米，或约80-100微米的平均大小；其中优选所述第一球体由3维(3D)球体培养产生，期间监测球体大小；

(b)在第二培养基中3D球体培养多个第一球体以诱导所述PSC分化产生多个第二球体，其包括造血内皮细胞(HEC)；

(c)在第三培养基中3D球体培养多个第二球体以诱导HEC分化产生多个第三球体，其包括造血祖细胞(HPC)；

(d)允许所述HPC从所述多个第三球体中释放以获得HPC的基本单细胞悬浮液；以及

(e)任选地，进一步分化所述HPC的基本单细胞悬液成为红系/巨核细胞共同祖细胞，红细胞，巨核细胞，血小板，淋巴样共同祖细胞，淋巴样谱系细胞，淋巴细胞(例如T淋巴细胞)，自然杀伤(NK)细胞，髓样共同祖细胞，粒单核细胞共同祖细胞，单核细胞，巨噬细胞，和/或树突细胞。

2.一种用于体外产生淋巴谱系细胞的方法，其包括：

(a)提供多个第一球体，其包含在第一培养基内的多能干细胞(PSC)，其中所述第一球体的直径达到约60-150微米，约70-120微米，或约80-100微米的平均大小；其中优选所述第一球体由3维(3D)球体培养产生，期间监测球体大小；

(b)在第二培养基中3D球体培养所述多个第一球体以诱导所述PSC分化产生多个第二球体，其包含造血内皮细胞(HEC)；

(c)酶解所述多个第二球体以获得HEC的基本单细胞悬浮液；

(d)将所述HEC的基本单细胞悬浮液接种到模拟体内造血生态龛的支架中；以及

(e)在所述支架内将所述HEC培养并分化成淋巴谱系细胞。

3.一种用于体外产生淋巴谱系细胞的方法，其包括：

(a)提供多个第一球体，其包含在第一培养基内的多能干细胞(PSC)，其中所述第一球体的直径达到约60-150微米，约70-120微米，或约80-100微米的平均大小；其中优选所述第一球体由3维(3D)球体培养产生，期间监测球体大小；

(b)在第二培养基中3D球体培养所述多个第一球体以诱导所述PSC分化产生多个第二球体，其包含造血内皮细胞(HEC)；以及

(c)在无支架第三培养基中，将所述第二球体中的所述HEC培养并分化为淋巴谱系细胞，期间允许所述淋巴谱系细胞从所述第二球体中释放出来。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述PCS是胚胎干细胞或诱导多能干细胞，优选来自人。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述PCS的Oct-4表达至少95％阳性。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中每个3D球体培养步骤包括在旋转瓶或搅拌罐生物反应器中培养，优选在连续搅拌下。

7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一培养基是PSC培养基，补充有约1-10ng/mL的TGF-13，约10-500ng/mL的bFGF，以及约1-5μM的Y27632。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述PSC培养基是mTeSR^TM1，mTeSR^TM2，TeSR^TM-E8^TM或其他适合3D悬浮培养的培养基。

9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述第二培养基是PSC培养基，补充有BMP4，VEGF和bFGF，每种优选浓度为约25至约50ng/mL，还可选地补充有CHIR99012和/或SB431542，各自优选浓度为约1-10，约2-5或约3μM。