[发明专利]肠道病毒对VERO细胞的适应及其疫苗制剂

权利要求书

1.一种肠道病毒D68，其适应于在Vero细胞中繁殖至高滴度，由具有SEQ ID No 1的核苷酸序列的cDNA分子编码。

2.一种核苷酸序列，其编码适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白，所述核苷酸序列在SEQ ID No 2中公开。

3.一种适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的氨基酸序列，在SEQ ID No3中公开。

4.一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖至高滴度的方法，包括以下步骤：

(a)通过在32-35℃，更准确地在32-33℃吸附约60-120分钟来感染病毒；

(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃添加维持培养基后繁殖病毒；

(c)以1:3至1:10的稀释度稀释从每次传代获得的病毒原液以感染接下来的Vero细胞批次，用于在32-35℃，更准确地在32-33℃进行病毒的初始传代；

(d)以1:20-1:500的稀释度稀释病毒以在32-35℃，更准确地在32-33℃在随后/后续的传代中感染Vero细胞；和

(e)在每次传代期间达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内收获病毒。

5.权利要求4所述的方法，其中肠道病毒D68病毒进行空斑测定，包括以下步骤：

(a)每12孔板或6孔板铺板300万至400万个Vero细胞以达到适合空斑测定的汇合度；

(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃，一式两份、一式三份或一式四份在不同孔中吸附不同稀释度的病毒1-2小时；

(c)以≤0.6％的羧甲基纤维素或0.8-1.8％的Avicel RC 591作为覆盖介质进行覆盖；

(d)用羧甲基纤维素作为覆盖物在感染后5-7天后或用Avicel RC 591作为覆盖物在感染后3-4天后，用10％福尔马林固定细胞；

(e)在固定后去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞；和

(f)将新鲜制备的染色液-结晶紫溶液逐滴加到固定的细胞中，并在室温染色30分钟至1小时或2小时。

6.一种灭活含有从SEQ ID No.1编码的cDNA的肠道病毒D68用于免疫的方法，包括以下步骤：

(a)对收获的肠道病毒D68病毒进行无菌过滤；

(b)使用核酸酶处理去除宿主核酸并使用100kDa过滤器通过切向流过滤进行浓缩；

(c)使用1/2000-1/4000福尔马林在从25-37℃变化的温度多至3周或使用BPL在4-25℃多至120小时或使用0.005％到3％的过氧化氢在25±5℃多至6小时来进行灭活；和

(d)灭活的抗原的纯化或在灭活病毒抗原之前的纯化如下进行：通过使用SepharoseCL-4B的凝胶过滤继之以使用DEAE树脂的阴离子交换层析，或者通过双步骤/两轮尺寸排阻层析，或者通过纤维素硫酸盐继之以阴离子交换层析，或者通过混合模式树脂如CHT II型(Biorad)单独地或与其他树脂组合，或者层析方法的组合。

7.一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的权利要求6中获得的灭活的肠道病毒D68病毒抗原和任选地一种或多种选自佐剂、稳定剂或防腐剂的药学上可接受的赋形剂。

8.权利要求7所述的免疫原性组合物，其中组合物在2-8℃稳定至少6个月并且在37℃稳定至少1个月。

9.权利要求7所述的免疫原性组合物，其中组合物还包含其他肠道病毒，包括EV71、脊髓灰质炎病毒或其组合。

10.一种属于肠道病毒D68的氨基酸序列，其在多蛋白中具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的氨基酸。

11.一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的灭活的肠道病毒D68病毒抗原，其中肠道病毒D68在多蛋白中具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的氨基酸。