[发明专利]二羧酸合成相关酶及使用其生产二羧酸的方法

说明书

本发明涉及二羧酸合成相关酶、编码该酶的基因以及使用该酶生产二羧酸的方法。本发明的基因或由该基因编码的酶代替现有的二羧酸化学生产，可用于生物酶法生产二羧酸，因此预期具有高的工业实用性。

技术领域

本发明涉及一种参与二羧酸(DCA)生产的酶、编码该酶的基因、包含该基因的载体以及使用该酶生产二羧酸的方法。

背景技术

二羧酸(Dicarboxylic acid，DCA)是含有两个羧基基团(-COOH)的有机化合物。二羧酸的分子通式可以用HO₂C-R-CO₂H来表示，其中R可以是脂肪族或芳香族基团。通常，二羧酸表现出类似于单羧酸的化学反应和反应性。二羧酸也用于制备共聚物，例如聚酰胺和聚酯。工业中使用最广泛的二羧酸是己二酸，它是用于生产尼龙的前体。二羧酸的其他例子包括天冬氨酸和谷氨酸，它们是人体中的两种氨基酸。此外，其他羧酸已用于各种工业领域。

此类二羧酸已通过化学工艺或生物方法制备。作为关于制备二羧酸的一个例子，作为二羧酸中的一种的癸二酸，即使使用苯酚和甲酚也可以合成它，但已知蓖麻油氧化是最环保且价格最具竞争力的方法。蓖麻油通过蒸汽裂解进行酯交换，并通过酯交换生产蓖麻油酸。将如此产生的蓖麻油酸在250℃下加热后与碱(例如熔融苛性钠等)混合，经苛性碱消化分解为辛醇(2-辛醇)和癸二酸。将如此产生的产物纯化以得到高纯度癸二酸(美国专利第5,952,517和6,392,074号)。然而，这种方法的缺点是需要在300℃或更高的高温处理下才能达到上述目的，并且使用诸如硫酸的强酸，以及由于使用了诸如重金属、有毒有机溶剂等物质而产生大量的环境污染物。除了使用化学方法制备癸二酸外，还可以通过电解己二酸单乙酯钾(Potassium monoethyl adipate)来进行这种生产。

在之前的研究中，已经报道了使用ω-氧化能力优异且β-氧化被阻断的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株通过生物方式来生产二羧酸。然而，没有关于具体二羧酸生物合成途径的报道。因此，确定二羧酸生物合成途径以开发能够大量生产二羧酸的有用菌株是重要的。

因此，本发明人已经发现通过使用产生二羧酸的热带假丝酵母菌株的进化方法来筛选与二羧酸生物合成相关的基因，并且使用这些基因来确定生物合成途径。因此，基于这些事实完成了本发明。

[相关技术文件]

[专利文件]

韩国专利申请第10-2015-0149253号

[非专利文件]

David L.Craft等人，《应用与环境微生物学》，69(10)：5983-5991，2003

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个目的是提供一种参与二羧酸(DCA)生物合成的蛋白质，该蛋白质包括选自以下中的一个或多个：脂肪酶(LIP1)、细胞色素P450 52B1(CYP52B1)、NADPH-细胞色素P450还原酶(NCP1)、长链醇氧化酶(FAO1)和醛脱氢酶(ALD1)。

本发明的另一个目的是提供包含编码该蛋白质的基因的重组载体，以及包含该重组载体的用于生产二羧酸的组合物。

本发明的又一个目的是提供一种用于生产二羧酸的方法，该方法包括培养用包含该基因的载体转化的微生物。

技术方案

在以前的研究中，二羧酸的生产是通过化学方法进行的，并且大多数已知生产二羧酸的菌株都由于易受到底物的细胞毒性的影响而死亡。因此，通过生物方法生产二羧酸或确定二羧酸生产途径并不容易。于是，本发明人使用先前研究中的进化方法制造了对细胞毒性底物具有高耐受性并且产生二羧酸的菌株，并从该菌株中筛选了与二羧酸生物合成相关的酶和编码该酶的基因。因此，基于这些事实完成了本发明。