[发明专利]使用泊洛沙胺的病毒传导

说明书

本发明提供一种组合物，包括或由下述物质组成：(a)泊洛沙胺；(b)(i)逆转录病毒载体；和(ii)脊椎动物细胞。

技术领域

本发明涉及一种组合物，含有或由(a)泊洛沙胺；和(b)(i)逆转录病毒载体和或(ii)脊椎动物细胞组成。

本文中引用了大量文件，包括专利申请及制造商手册。这些文件的披露虽然不被认为与本发明的可专利性有关，但在此以整体引用的方式纳入本发明中。更具体的，所有引用的文件都通过相同程度的引用来纳入，就像每个单独的文件都明确地、单独地指明是通过引用来纳入的一样。

背景技术

对于大部分细胞，特别是原代细胞的遗传修饰，优选的方法是通过病毒载体的介导转导。尤其是，使用逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。具有水泡性口炎病毒(VSV-G)的糖蛋白的假型慢病毒(LV)载体稳定地整合到增殖和非增殖细胞的染色体中(布克林斯基(Bukrinsky)等，1993；伯恩斯(Burns)等，1993；芬克(Funke)等，2008)。LV的安全特性得到了改进，如第三代分裂基因组慢病毒的包装设计和转移载体3'长末端重复序列(LTR)的缺失等，使LV成为许多研究者青睐的系统(杜尔(Dull)等，1998)。经转导的慢病毒细胞几乎不显示应激信号通路的激活或任何其他表型改变，因此有望在基因治疗和免疫治疗中得到广泛应用(格鲁伯(Gruber)等，2000；鲁阿斯(Rouas)，2002)。

目前而言，在研究及临床实验中，涉及将LV基因有效传递到靶细胞的转导条件存在很大差异(米林顿(Millington)等，2009)。众所周知，正常的淋巴细胞和原发性肿瘤，以及淋巴系的细胞系难以有效转导(阿纳斯塔索夫(Anastasov)等，2009)(阿纳斯塔索夫(Anastasov)等，2010)。为了大规模转导病人细胞，向原代细胞的高基因转移率和能够产生高滴度病毒颗粒的能力是临床试验的先决条件。由于大规模生产这些病毒是十分复杂和昂贵的(乌姆(Wurm)等，2010)，对慢病毒转导率的每一项改进都将导致对病毒产量需求的减少，并将进一步有助于降低临床试验的成本。

可以通过各种不同的策略实现更高的基因转移效率：通过超速离心法(伯恩斯(Burns)等，1993)或超滤法(阿纳斯塔索夫(Anastasov)等，2009)浓缩病毒上清液也是一种可能提高基因转移效率的方法。其他被频繁使用的、用于提高基因转移率的方法为添加不同的试剂，例如聚阳离子或阳离子脂质体。但是，大部分这些辅助疗法对于细胞而言是有毒的，限制了其用于原发灶的敏感的靶细胞(乌姆(Wurm)等，2010)。在其他选项中，凝聚胺(一种线性聚阳离子聚合物)在大范围的靶细胞中提高了基因转导率，成为了本领域中一种主流的转导辅助试剂(卡斯特罗(Castro)等，1988；海塞(Hesse)，埃贝桑(Ebbesen)和克里斯滕森(Kristensen)，1978)。可惜，凝聚胺仅可作用于很短的应用时间，以及低于10ug/ml的浓度(取决于靶细胞的类型)，可用于避免细胞毒副作用和/或跨膜电位的显著调节(奥宾，尔德和帕特森(Aubin,Weinfeld,and Paterson)，1988)，这限制了其在敏感细胞，例如造血细胞中的使用。

另一种提高病毒转导效率的常规方法为使用纤维连接蛋白，能够促进慢病毒和靶细胞共定位的重组人纤维连接蛋白片段(李(Lee)等，2009)。

Vectofusin-1是一种相对较新的病毒转导增强子。它源于LHA4肽族，是一种富含组氨酸的阳离子两亲性肽(弗纳德(Fenard)等，2013)。它的作用是促进病毒和细胞膜之间的贴壁和融合，并被证明可以改善人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的转导(弗纳德(Fenard)等，2013；因戈劳(Ingrao)等，2014)。

进一步的，将病毒添加到细胞后，直接离心接种(通常称为“旋转接种(spinoculation)”)被转导的细胞也可以加强转导(郭(Guo)等，2011)。研究表明，离心诱发动态肌动蛋白和丝切蛋白的活性，导致HIV-1受体和CD4和CXCR4共同受体的上调(郭(Guo)等，2011)。旋转接种也可以与转导增强子共同使用以进一步增强转导效率。