[发明专利]长期培养肝细胞的组合物和方法

权利要求书

1.补充的肝细胞细胞培养组合物，其包含有效量的选自由以下组成的组的至少一种因子：腺苷酸环化酶激活剂、TGFβ抑制剂、Notch抑制剂、Wnt抑制剂和BMP抑制剂，以体外长期维持功能性肝细胞功能，如以下所测量的：与在不含至少两种因子的未补充培养组合物中培养的肝细胞相比，在补充的细胞培养组合物中体外肝细胞培养至少两周后，至少一种肝细胞标志物的表达增加。

2.根据权利要求1所述的组合物，其包含腺苷酸环化酶激活剂和TGFβ抑制剂的组合。

3.根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含至少一种Notch抑制剂、一种Wnt抑制剂和一种BMP抑制剂。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其包含至少一种腺苷酸环化酶激活剂、一种TGFβ抑制剂、一种Notch抑制剂、一种Wnt抑制剂和一种BMP抑制剂的组合(“5C”)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述腺苷酸环化酶激活剂是毛喉素。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述TGFβ抑制剂是SB431542(SB43)。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述Notch抑制剂是DAPT。

8.根据利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述Wnt抑制剂是IWP 2。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述BMP抑制剂为LDN193189。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述肝细胞功能蛋白选自由白蛋白(ALB)、CPS1、ARG、NAGS、PXR、CAR、APOA2、APOB、F2、F10、细胞色素P450(CYP)3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、NTCP、PXR、CAR 和UGT2B7组成的组。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述肝细胞在培养至少60天后表达至少6种肝细胞功能蛋白，其水平与来自相同生物体的新鲜分离的原代肝细胞(F-PHH)相同。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述肝细胞在培养至少90天后表达至少六种肝细胞功能蛋白，其水平与来自相同生物体的F-PHH相同。

13.根据权利要求1-9中任一项所述的方法培养的肝细胞。

14.根据权利要求13所述的肝细胞，其中所述肝细胞在体外培养至少两周后具有选自由以下组成的组的至少一种特征：肝细胞形态(多边形)、已建立的肝细胞功能例如白蛋白分泌和尿素合成、和表达至少一种已知肝细胞标志物。

15.根据权利要求14所述的肝细胞，其中所述肝细胞在培养3至8周后具有至少一种特征。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的肝细胞，其中所述至少一种肝细胞标志物选自由细胞色素P450(CYP)3A4；CYP1A2；CYP2C9；CYP2D6；CYP2B6；CYP2C19；UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)1A3；UGT1A4；UGT2B15；UGT2B7，NTCP(Na+-牛磺胆酸盐共转运多肽)；ABCG2(ATP结合盒超家族G成员2；MRP2(多药耐药相关蛋白2)；和有机阴离子转运多肽(OATP)1B1组成的组。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的肝细胞，其中当与来自相同生物体的新鲜分离的肝细胞表达的水平相比时，所述肝细胞以可比的水平(测量为无统计学显著差异)或更多地表达所列出的至少一种肝细胞标志物。