[发明专利]安全的牛肝素、制备方法和应用

说明书

本发明涉及用于放大规模生产安全的牛肝素的制备方法，及其生产方法和应用，所述安全的牛肝素由不同选择的未分级的牛肝素聚合物组成，其具有低6‑O‑脱硫酸化的葡糖胺含量和猪样抗凝血活性以及鱼精蛋白中和。这种安全的牛肝素(SB肝素)具有与猪肝素(临床使用参考)可比的结构和功能，作为安全的药学产品可预防临床使用障碍，允许其作为可互换的药物使用。

技术领域

本发明涉及新的且安全的牛肝素的制备，其是来自牛肠黏膜的安全的抗凝血药剂(medication)，涉及药物发现与制造的生物技术医学领域。

概述

安全的牛肝素，其是来自牛肠黏膜的具有低的6-O-脱硫酸化的葡糖胺(6-O-desulfated glucosamine)含量和猪样的(porcine-like)抗凝血活性以及鱼精蛋白中和的未分级的肝素，以及其制备方法和应用。

背景技术

糖胺聚糖(GAGs)是线性复杂的杂多糖，其被发现作为细胞外基质(EMC)、细胞表面和细胞内空间(intracellular space)的组分。GAGs的历史可以追溯到19世纪，当时硫酸软骨素(CS)被首次鉴定为软骨的组分，并且它的结构被进一步阐明(DAVIDSON和MEYER,1954)。CS是由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的二糖重复单元组成的聚合物，其可在N-乙酰半乳糖胺[→4-β-GlcA-(1→3)-β-GalNAc-(4S)(6S)-1→]的4位或6位被硫酸化。随后的研究表明，CS在自然界中广泛分布，与进一步描述的其他GAGs相似。

奇怪的是，在20世纪初，对于不同组织提取物中促凝血的磷脂的研究发现了抗凝血的GAG。狗肝脏酒精提取物产生了具有出乎意料的抗凝血作用的“脂溶性”级分。所述抗凝血作用与名为肝素(heparin)(hepar是希腊词中的肝脏)的碳水化合物的存在有关(Howell和Holt,1918)(Howell,1925)。后来，NMR分析技术的使用表明肝素由艾杜糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的重复二糖单元组成，其主要在N-、6-O-、2-O-位硫酸化[→4-β-IdoA-(2S)-1-(1→4)-α-GlcNAc-(NS)(6S)-1→](Cifonelli和Dorfman,1962)。

尽管有关结构和生物学功能的信息有限，但对抗凝血药物的需求推动了晶体形式的肝素在临床试验中进行测试并进入医药市场(Wardrop和Keeling，2008)，证明了其作为抗凝血药物的临床相关性和需求。

后来在色谱法和NMR分析技术上的发展可以阐明用于特定GAG-蛋白质结合相互作用所需的基序(motifs)。与生长因子结合的肝素的HPLC和NMR分析表明，2-O硫酸化的艾杜糖醛酸(Habuchi等人，1992)对于特定的生长因子相互作用(bFGF结合而不是用于FGF-2，FGF-2反而需要6-O硫酸化的N-乙酰葡糖胺(Maccarana等人,1993))是必不可少的。另一方面，除了其他结构修饰外，介导肝素-抗凝血酶III结合和抑制的多糖结合位点需要罕见的N-乙酰葡糖胺上的3-O-硫酸化(Lindahl等人，1980)。这些早期的实例显示了肝素结构调节其相互作用并决定其生物学功能的显著意义。

尽管狗肝脏是肝素的最初来源，但从更实际的观点来看，针对生产的分析表明，从不同组织中提取的肝素制备物显示出在牛肠和肺中高浓度的这种GAG，其被选为临床使用的早期肝素来源。牛未分级肝素(UFH)最初于1939年在美国卫生系统市场上上市，并且此后销售了超过50年。

在80年代早期/中期，由于牛海绵状脑病(BSE)污染的风险，来自牛来源的UFH肝素自发地从主要市场撤出，使得猪黏膜肝素几乎成为全球肝素市场的专有的供应。

然而，这种挽救生命的药物在世界范围内的大量使用使肝素生产面临短缺风险，因为其来源仅限于猪源。此外，由于肝素主要由一种动物来源(猪)和地理区域(中国)生产，因此原材料供应变化导致短缺的风险更高。