[发明专利]基于新型荧光染料的用于自动高性能鉴别碳水化合物和碳水化合物混合物组成模式的先进方法和系统以及用于校准多波长荧光检测系统的方法

权利要求书

1.一种用于自动测定和/或鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)获得含有至少一种碳水化合物的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物；

c)提供用第二荧光标记物标记的已知组成的标准品；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测来测定所述碳水化合物和已知组成的标准品的迁移/保留时间；

e)基于该标准品的给定标准迁移/保留时间指数，将迁移/保留时间与迁移/保留时间指数进行对齐；

f)将碳水化合物的这些迁移/保留时间指数与来自数据库的标准迁移/保留时间指数进行比较；

g)鉴别或测定碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式，

其中将该标准品组合物加入到含有未知碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成的样品中，该第一荧光标记和该第二荧光标记是不同的，并且其中该第一荧光标记或该第二荧光标记是荧光染料，优选具有多个可离子化的和/或带负电荷的基团，所述荧光染料选自由下述通式A和B的化合物组成的组：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵彼此独立并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链的C₃-C₁₂、优选C₃-C₆，烷基或全氟烷基，磷酸化的烷基(CH₂)_mP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链的烷基链，(CH₂)_nCOOH，其中n＝1-12、优选1-5，或(CH₂)_nCOOR⁶，其中n＝1-12、优选1-5，并且R⁶可以是烷基，特别是C₁-C₆烷基、CH₂CN、苄基，芴-9-基、多卤代烷基、多卤代苯基，例如，四或五氟苯基、五氯苯基、2-和4-硝基苯基、N-琥珀酰亚胺基(N-succinimidyl)、磺基-N-琥珀酰亚胺基(sulfo-N-succinimidyl)、1-氧基苯并三唑(1-oxybenzotriazolyl)或其他潜在的亲核反应性离去基团，烷基磺酸盐((CH₂)_nSO₃H)或烷基硫酸盐((CH₂)_nOSO₃H)，其中n＝1-12、优选1-5，并且任何(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；

羟烷基(CH₂)_mOH或硫代烷基(CH₂)_mSH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(CH₂)_mOP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁷或COOR⁷，其中m＝1-12且R⁷＝甲基、乙基、叔丁基、苄基、芴-9-基、CH₂CN、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑、苯基、取代苯基，例如2-或4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟苯基、2-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶-4-基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立并且代表氢和/或C₁-C₄烷基，羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝2-6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(CH₂)_mOP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；

烷基叠氮化物(CH₂)_mN₃，其中m＝1-12，优选2-6，具有直链或支链烷基链；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵可以含有末端烷氧基氨基(CH₂)_mONH₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链，其可以包括在m＝0-12的所有可能的组合中的一个或多个烷基氨基(CH₂)_mNH或烷基酰胺基(CH₂)_mCONH；

(CH₂)_nCONHR⁸，其中n＝1-12、优选1-5；R⁸＝H，C₁-C₆烷基，(CH₂)_mN₃，或(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基((CH₂)_m-N-maleimido)，(CH₂)_m-NH-COCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝1-12、优选2-6，并且在(CH₂)_n、(CH₂)_m和R⁸中具有直链或支链烷基链；

伯氨基，优选为R¹、R²或R³，其形成芳基肼；

羟基，优选为R²或R³，其形成芳基羟胺；

进一步，残基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵的其中一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；

此外，R²---R³和/或(R⁴---R⁵)可以形成四元、五元、六元或七元环，或具有或不具有连接到该环中一个碳原子上的伯氨基NH₂、仲氨基NHR^a的四元、五元、六元或七元环，其中R^a＝C₁-C₆烷基、羟基OH或磷酸化羟基-OP(O)(OH)₂；

任选地，R²---R³(R⁴---R⁵)可以形成四元、五元、六元或七元杂环，该杂环中还包含1-3个杂原子，例如O、N或S；

进一步，R¹可以代表未取代的苯基、具有一个或数个选自OH、SH、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、R^aO、R^aS的组的电子给体取代基的苯基，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是具有直链或支链碳链的C₁-C₆烷基，具有一个或数个选自NO₂、CN、COH、COOH、CH＝CHCN、CH＝C(CN)₂、SO₂R^a、COR^a、COOR^a、CH＝CHCOR^a、CH＝CHCOOR^a、CONHR^a、SO₂NR^aR^b、CONR^aR^b的组的电子受体的苯基，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是H或具有直链或支链碳链的C₁-C₆烷基；

或者R¹可以代表杂芳族基团；

但条件是在上述式A的所有化合物中，在碱性条件下，即7pH14，存在至少两个，优选至少3、4、5或6个带负电荷的基团，并且这些带负电荷的基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，磺酸残基SO₃H，伯磷酸基团OP(O)(OH)₂，仲磷酸基团OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，伯膦酸基团P(O)(OH)₂，仲膦酸基团OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基；

并且式A的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺和有机铵或有机鏻阳离子的盐；

其中R¹和/或R²彼此独立并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链C₃-C₁₂烷基或全氟烷基，或取代的C₂-C₁₂烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR³，其中n＝1-12、优选1-5，R³可以是H，烷基、特别是C₁-C₆，CH₂CN，苄基，芴-9基，多卤代烷基，多卤代苯基，例如四或五氟苯基、五氯苯基、2-和4-硝基苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基或其他潜在的亲核反应性离去基团，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R₁---R₂可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环带有连接到该环的一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂、仲氨基NHR^a，其中R^a＝C₁-C₆烷基、或羟基OH；任选地，R₁---R₂可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，在该杂环中包含附加的杂原子，例如O、N或S；

羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁴或COOR⁴，其中m＝1-12且R⁴＝甲基、乙基、2-氯-乙基、N-琥珀酰亚胺基，磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基、苯基或取代苯基，例如2-或4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟-苯基、2-吡啶基或4-吡啶基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立，并且可以是H，或任选取代的C₁-C₄烷基，特别地，R¹或R²基团的其中一个可以是其中m＝2-6、且具有直链或支链烷基链的烷基叠氮化物基团(CH₂)_mN₃；R¹或R²的其中一个可以是n＝1-12的(CH₂)_nSO₂NR⁵NH₂，而取代基R⁵可以由H、烷基、羟烷基或全氟烷基基团C₁-C₁₂表示；

R¹或R²基团的其中一个可以是伯氨基，以形成芳基肼Ar-NR⁶NH₂，其中Ar是在式B中的整个芘残基，并且R⁶＝H或烷基；R¹或R²基团的其中一个可以是羟基以形成芳基羟胺Ar-NR⁷OH，其中Ar是式B中的整个芘残基，并且R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团的其中一个可以含有n＝1-12的末端烷氧基氨基(CH₂)_nONH₂，其可以通过m＝0-12所有可能组合中的一个或多个烷基氨基(CH₂)_mNH或烷基酰胺基(CH₂)_mCONH、烷基醚或烷基酯基团而被连接；

R¹或R²基团的其中一个可以是CO(CH₂)NCOOR⁸，其中n＝1-5，具有直链或支链烷基链(CH₂)_n，并且R⁸选自H、直链或支链C₁-C₆烷基、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基；

进一步，R¹或R²的其中一个可以是(CH₂)_nCONHR⁹，其中n＝1-5且R⁹＝H、C₁-C₆烷基、(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝2-6并且在(CH₂)_n和R⁹中具有直链或支链烷基链；

或者R¹或R²的其中一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；或者R¹或R²的其中一个可以是烷基叠氮(CH)N₃或炔烃，特别是炔丙基；

接头L包含至少一个碳原子，并且可以包含烷基，杂烷基，特别是烷氧基如CH₂OCH₂、CH₂CH₂O、CH₂CH₂OCH₂，烷氨基或二烷氨基，特别是二乙醇胺或N-甲基(烷基)一乙醇胺部分如N(CH₃)CH₂CH₂O-和N(CH₂CH₂O-)₂，全氟烷基如单或多二氟甲基(CF₂)，烯烃或炔烃部分，以任何组合，在任何情况下，直链或支链的，长度范围从C₁至C₁₂；

接头L还可以包括羰基(CH₂CO，CF₂CO)部分，还可以作为酰胺基的一部分；

接头L还可以包含或含有1，3，5-三嗪的残基，从而为X基团提供两个附着点；

X表示增溶和/或可离子化的阴离子提供部分，特别是由选自以下的组的部分组成或包括选自以下的组的部分，所述组包括：羟烷基(CH₂)_nOH、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_nCO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n是0至12的整数，或其类似物，其中一个或多个CH₂基团被CF₂取代，

进一步，阴离子提供部分可以通过非芳族的含O、N和S的杂环连接，例如哌嗪类、哌可啉类(pipecloines)，或者，可替换地，基团X的其中一个可以承载上面为基团R¹和R²列出的任何部分，也可以带有为基团L列出的任何类型的连接，并且独立于其他取代基；

式B的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在，并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺或有机铵。

但条件是在由式B表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7pH14，在式B的残基X中存在三个或六个带负电荷的基团，并且这些带负电荷的基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基；

并且式B的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在，并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na+、Li+、K+和有机铵或有机鏻阳离子的盐；