[发明专利]以皮肤中的活性型PAR-2为指标的皮肤状态评价方法、PAR-2激活促进剂或抑制剂的筛选方法和PAR-2激活抑制剂

说明书

以往的PAR‑2抑制作用的评价方法和/或筛选方法是通过以在表达PAR‑2的培养细胞中PAR‑2激活以后引起的细胞内的反应为指标来间接评价PAR‑2激活的方法，存在不能准确地评价实际的组织、例如皮肤等中的PAR‑2激活这样的问题。发现通过使用检测PAR‑2蛋白质的N末端的切割的抗体，能够基于PAR‑2的切割状态评价PAR‑2激活。利用该抗体评价皮肤中的PAR‑2激活，结果明确了通过胰蛋白酶处理和/或外部刺激产生PAR‑2激活的部位。使用检测PAR‑2蛋白质的N末端的切割的抗体，着眼于皮肤中的该部位，由此提供筛选PAR‑2激活抑制剂或PAR‑2激活促进剂的新方法。

技术领域

本发明涉及以皮肤中的活性型PAR-2为指标的皮肤状态评价方法、以及以PAR-2活性为指标的PAR-2激活剂或抑制剂的筛选方法。并且也涉及根据本发明所涉及的筛选方法选择出来的PAR-2激活抑制剂。

背景技术

蛋白酶受体(PAR：Protease Activated Receptor)是被特定的蛋白酶激活的G蛋白偶联七次跨膜型受体的一种。到现在为止鉴定了四个PAR家族(PAR-1～4)。PAR-1、3和4是凝血酶受体，另一方面PAR-2不会被凝血酶激活。已知PAR-2被胰蛋白酶、类胰蛋白酶(tryptase)、第Ⅶa因子、第Ⅹa因子等激活。PAR-2是通过PAR-2的N末端的部分肽被这些蛋白酶切割，生成新的N末端，包含这些新的N末端的肽作为配体发挥作用，从而激活的。此外，有报道基于经切割产生的新的N末端的肽的序列的合成肽能够激活PAR-2。已知PAR-2广泛分布于内皮性的组织，特别是在消化器官、循环器官、呼吸器官、神经、皮肤等中高表达。

表皮角质形成细胞的PAR-2(Protease Activated Receptor-2)与特应性皮炎、银屑病的病态、皮肤屏障的恒定性、发痒、炎症有关。如果PAR-2被蛋白酶切割而激活，则介由G蛋白质产生肌醇三磷酸(IP3)，使细胞内钙升高，动员NF-κB(Nuclear Factor-kappa B)等转录因子，从而使TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin，胸腺基质淋巴细胞生成素)等炎症性细胞因子的产生增加。表皮的颗粒层中细胞外钙的升高抑制板层颗粒释放，使屏障恢复延迟。认为TSLP等炎症性细胞因子刺激皮肤内的感觉神经而引起发痒。

于是关于在生理上担当重要的作用的PAR-2，开发出了对于特定的化合物评价PAR-2抑制作用的方法、筛选方法(专利文献1：日本专利第4728248号、专利文献2：日本特表2012-519735号、专利文献3：日本特开2004-170323号)。目前为止的PAR-2抑制剂的筛选法是利用表达PAR-2的培养细胞，测定在PAR-2激活以后引起的细胞内的反应、例如钙浓度变化、细胞因子的释放量等作为指标的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4728248号公报

专利文献2：日本特表2012-519735号公报

专利文献3：日本特开2004-170323号公报

专利文献4：日本特开平9-227367号公报

发明内容

发明要解决的课题

以往实行的以PAR-2激活以后引起的细胞内反应为指标的PAR-2抑制作用的评价方法、筛选方法基于间接地评价PAR-2激活。由于这些评价方法不是直接测定PAR-2激活，因此存在将基于试验物质的其它生理作用的反应误认成对PAR-2的作用的可能性。此外，由于以往的方法是在培养细胞中进行筛选，因此存在无法获得反映实际的组织、例如皮肤中产生的PAR-2激活的结果的问题。

用于解决课题的手段