[发明专利]一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法

权利要求书

1.一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)全国范围内选取不同地区发病鸡场的病料，分离制得鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒四种种毒，灭活处理后按一定的体积比混合，制得抗原混合液；

2)向50份聚乙二醇溶液中加入4份蜂胶，边加热边搅拌，至溶解后，依次向其中加入2份黄芪多糖和3份鹰豆芽素A，搅拌均匀后，得到疫苗佐剂；

3)将步骤1)所得的抗原混合液与步骤2)所得的疫苗佐剂以(1～2.5):(1～3)(v/v)的比例混合均匀，即得到多联疫苗；

4)利用步骤3)所得的多联疫苗免疫蛋鸡，蛋鸡产蛋前15天免疫1次，10天后二免，二免10天后再次加强免疫，病毒达标后，开始收集高免蛋；

5)取步骤4)所得的高免蛋消毒，而后收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60～65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用；

6)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤5)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2～4小时，离心取上清备用；

7)向步骤6)分离的上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，充分搅拌，室温放置2～6小时后，以4200～5500r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3～4倍后再用NaOH调整PH值为6.8～7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌；

8)取步骤7)所述滤液，而后按终浓度0.1％(v/v)加入甲醛，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2～8℃保存，即得到所述一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤1)中灭活的病毒液是通过以下方法制备的：将4种毒种分别用灭菌生理盐水稀释10³～10⁴倍，经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，封孔后，置36～37℃继续孵育120小时；接种后24小时照胚，弃去24小时前的死胚，之后每4小时照胚一次，24～120小时死亡的鸡胚随时取出，置于2～8℃冷却12～24小时；将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集典型病变鸡胚的尿囊液和胎儿。收集时逐个检查胚胎病变，凡胎儿腐败、胚液浑浊，或胎儿新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒所引起的特征性病变者，弃去不用。若干枚鸡胚的尿囊液和胎儿混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以4200r/min离心30分钟，取上清液置于灭菌容器内灭菌，即得病毒液，置-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种用于水禽的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤4)所述病毒达标是指母鸡血清中新城疫抗体血凝抑制效价≥2¹¹、H9亚型流感抗体血凝抑制效价≥2¹²、马立克氏病毒抗体血凝抑制效价≥2¹⁰、法氏囊抗体琼扩效价≥1:256时。

4.根据权利要求1所述的一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤5)种所述的消毒高免蛋和收集发卵黄的方法为：取步骤4)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。

5.根据权利要求1所述的一种用于鸡病毒病的多联卵黄抗体制备方法，其特征在于步骤6)中所述的酸化用水的制备方法为：预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备，稀释调制pH值5.0后冷却至4℃。