[发明专利]耐高温毕赤酵母菌株

说明书

本发明涉及耐高温毕赤酵母菌株。具体地，本发明涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）菌株，其在28‑34ºC，特别是34ºC的发酵温度下相对于未突变的菌株的外源蛋白生长速度和/或生产能力提高。本发明还涉及所述菌株的各种用途。

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株和用该菌株得到的重组菌株、生物催化剂等，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。

背景技术

随着基因操作技术的日臻成熟，生物表达系统的出现很快地迎合了世界各地科学家的需求，逐渐成为解决工业、农业以及医疗卫生等领域问题的主要手段之一。生物表达系统中尤以巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）表达系统研究最为广泛，是20世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统。该系统相较其他表达系统，弥补了大肠杆菌表达系统不易表达复杂蛋白的限制以及植物、动物细胞表达系统周期长、操作繁琐、成本高的缺点，完善了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，迅速成为各国科学工作者的研究宠儿。迄今为止，已有数百多种外源蛋白在此体系中成功表达，且数量在不断增加。

由于毕赤酵母在工业微生物发酵中应用广泛，控温能耗问题使得耐高温酵母的需要越来越迫切。毕赤酵母的最适生长温度为30 ºC，发酵诱导温度在28 ºC以下，所以在工业发酵过程中需要大量的冷却水来保证酵母的正常发酵生产。利用高温酵母菌进行发酵生产可以在较高温度条件下实现菌株的正常生长与蛋白表达，从而减少生产中由于降温而产生的能耗费用。且对于耐高温酵母菌株来说，它们具有生长速度快，生产效率高、不易污染杂菌等优点。它们所合成的酶与适温同类酵母菌株产生的酶相比，高温时具有更好的酶活性。因此围绕耐高温酵母菌株的选育已经成为研究的热点。目前，耐高温酵母菌株的选育方法主要集中在自然筛选和高温驯化，也有研究者才用分子生物学手段来改造酵母菌，使耐高温酵母菌株的研究取得了显著进展。ARTP（常压室温等离子诱变技术）作为一种操作简易的新型诱变技术已被证明能快速且有效地突变酵母菌和细菌等微生物。

但是，本领域仍然需要具有在较高温度下生长速度更快，具有更高生产效率的耐高温毕赤酵母。

发明内容

本研究采用ARTP诱变和高温驯化结合的方式解决了上述问题。本发明在实验室前期改造的毕赤酵母m316H（CGMCC No. 19221）的基础上，通过ARTP诱变的方法，得到了具有良好的耐高温性能的突变毕赤酵母菌株，该菌株能够高效地表达外源基因。

具体地，本发明涉及以下方面。

一方面，本发明涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）菌株，其在28-34 ºC的发酵温度，特别是34 ºC下相对于未突变的菌株的生长速度提高和/或外源蛋白生产能力提高。

在一个具体实施方案中，本发明的耐热巴斯德毕赤酵母菌株具有CGMCC No.18764的保藏号。

本发明的耐热巴斯德毕赤酵母菌株在高温条件进行发酵，在发酵过程不需要加入冷却水来保证酵母的正常发酵生产，因此节约了能耗。在具体实施方案中，发酵温度可以是28-34 ºC。特别是，在34 ºC的高温下，本发明的耐热巴斯德毕赤酵母菌株相对于未突变的出发菌株的蛋白产量显著提高。具体地，其在相同条件下相对于未突变的对照菌株生产的蛋白量，可以提高10%至2倍，例如，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%，140%，150%，160%，170%，180%，190%，特别是124%。