[发明专利]利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法

说明书

本发明公开了利用BmIML‑2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，所述方法在上蔟前最后一次给桑时添食核型多角体病毒，并以BmIML‑2基因的转录水平为检测指标，判断家蚕对病毒的抗性强弱。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述方法选择5龄期上蔟前添毒，能够缩短试验周期，工作量小，且减少家蚕之间相互交叉感染的几率；(2)本发明所述方法筛选后的家蚕品种对核型多角体病毒的抗性提高10‑100倍；(3)本发明所述方法筛选后的家蚕品种经多代饲养抗性稳定，体质强健。

技术领域

本发明属于家蚕良种选育技术领域，涉及一种采用基因工程方法选育家蚕抗病毒品种的技术，具体为利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法。

背景技术

家蚕作为重要的经济昆虫和模式昆虫，在科学研究、丝绸生产以及促进农民增收等方面意义重大。由家蚕核型多角体病毒引发的家蚕血液型脓病是蚕业生产上危害最为严重的蚕病，该病传染性极强且难于防控，所造成的经济损失占蚕病总损失的70％～80％。关于家蚕核型多角体病毒抗性品种的培育一直是业界重要的研究方向，家蚕核型多角体病毒抗性关键基因的筛选也是科研工作者培育家蚕抗性新品种的重要工作之一。传统的筛选方法在家蚕2龄或3龄等幼虫期进行病毒添食，该方法在蚕期容易污染家蚕饲养环境，造成家蚕之间的相互感染。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明通过在上蔟前最后一次给桑时添食家蚕核型多角体病毒，并以免疫相关基因的转录水平为检测指标来筛选对核型多角体病毒高抗性的品种；鉴于此，本发明提供了利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法。

技术方案：利用BmIML-2基因筛选家蚕核型多角体病毒病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)选取至少一个家蚕品种为试验材料并饲养至5龄期；采用核型多角体病毒溶液浸泡新鲜桑叶；

(2)待上蔟前最后一次给桑时，向每个品种的家蚕幼虫添食步骤(1)的桑叶，然后继续饲养直至上蔟结茧，期间淘汰病死蛹，发蛾后制种；

(3)取步骤(2)制种的蚕蛾，提取组织中的RNA并反转录为cDNA，根据BmIML-2基因全长序列设计引物，以cDNA为模板，通过RT-PCR检测家蚕BmIML-2基因在每个家蚕品种中的转录水平差异；

(4)根据步骤(3)的RT-PCR检测结果，筛选添食核型多角体病毒后BmIML-2基因转录水平显著上调的品种及个体所产蚕卵留种继代；

(5)重复步骤(1)至步骤(4)，对继代的家蚕品种进行重复筛选6代以上，获得家蚕核型多角体病毒病抗性品种。

优选的，步骤(1)中选取的家蚕品种为波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB和菁松。

优选的，步骤(1)中核型多角体病毒溶液的浓度为1×10⁶-5×10⁷个/mL。

优选的，步骤(3)中所述的引物序列为：

F(SEQ ID NO.1)：5’-AGAGTTCGTGTGGCATCTA-3’，

R(SEQ ID NO.2)：5’-ACCATATGAGAGGCAGGGTT-3’。

优选的，步骤(3)中所述组织为脂肪体。

优选的，步骤(3)中RT-PCR检测的内参基因选用BmGAPDH基因。

优选的，验证步骤(5)获得的家蚕品种核型多角体病毒病抗性：将留种继代的蚕卵催青、饲养至2龄起蚕，然后添食核型多角体病毒，继续饲养至4龄起蚕后统计生存率。

优选的，以下家蚕品种：波照、白玉C3VR6、白玉CB、PAB对核型多角体病毒的抗性比菁松提高了10-100倍。