[发明专利]一种筛查前列腺癌的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，包括：ERG引物及其探针、SPDF引物及其探针、MAX引物及其探针、IL32引物及其探针、PDGFA引物及其探针；内对照为SPK引物及其探针。

2.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述ERG引物及其探针为：

上游引物ERG-F GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG

下游引物ERG-R CTGGCCACTGCCTGGATT

探针：

Probe1 FAM-CTTGGACCA/ZEN/ACAAGTAGCCGCCTTGC-BHQ1。

3.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述SPDEF引物及其探针为：

上游引物SPDEF-F CCACCTGGACATCTGGAAG

下游引物SPDEF-R CTGGCCACTGCCTGGATT

探针：Probe2 VIC-CGGCCTGGA/ZEN/TGAAAGAGCG -BHQ1。

4.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述MAX引物及其探针为：

上游引物MAX-F AAGGGATGAGACTATGTG

下游引物MAX-R GGAGATAATGTTGAGTGC

探针：Probe3 CY5-CCTAACATCCACAGAGACATTGCTTG-BHQ2。

5.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述IL32引物及其探针为：

上游引物IL32-F CTCTCTCGGGTAAGTCTC

下游引物IL32-R CCTGGCACAAATACTCAG

探针：Probe4 FAM-TCTCTGTCTGTCTCTGTCTCTGTCT-BHQ1。

6.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述PDGFA引物及其探针为：

上游引物PDGFA -F TTGGGTAAAGATTTGTGATTA

下游引物PDGFA -R TCCTGTGGTTAGATTAGAC

探针：Probe5 CY5-CAAGAAGCATCCAACCTGAGCC-BHQ2。

7.根据权利要求1所述的一种筛查前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述SPK引物及其探针为：

上游引物SPK-F CCTTGAACCATTATGCTG

下游引物SPK-R CCGATACTTCTCACTCTC

探针：Probe6 VIC-ACCAATGAAGACCTCCTGACCAA-BHQ1。

8.一种筛查前列腺癌的方法，其特征在于，

S10.提取尿液样品的外泌体；

S20.提取外泌体的RNA，得到外泌体的mRNA；

S30.对mRNA进行RT-PCR，得到cDNA；

S40.对cDNA进行qPCR，采用权利要求1~3中任一项所述的试剂盒；

S50.获取SPK基因的及ERG、SPDEF、MAX、IL32、PDGFA的CT值，若SPK基因的CT值＜36，且其余5种基因中任一种基因的CT值＜36，则前列腺癌风险高。

9.根据权利要求8所述的一种筛查前列腺癌的方法，其特征在于，所述提取尿液样品的外泌体的方法为：

S11.将样品在室温下2800~3200g离心10~20min；

S12.取上清液15~25ml，加入3~5ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置12~24h，得到混合液；

S13.将混合液在4℃下6000~8000g离心20~40min；

S14.去除上清液，残留物在4℃下6000~8000g离心3~7min，彻底去除上清液，得到的沉淀即为外泌体。

10.根据权利要求8所述的一种筛查前列腺癌的方法，其特征在于，所述qPCR包括：

S41.取PCR mix20~30μL，5~15μM第一引物混合物3~6μL，5~15μM第一探针混合物0.3~3μL，NF水9~12μL，混匀得到第一反应液；取取PCR mix20~30μL，5~15μM第二引物混合物3~6μL，5~15μM第二探针混合物0.3~3μL，NF水9~12μL，混匀得到第二反应液；所述第一引物混合物包括ERG引物1~2μL、SPDEF引物1~2μL、MAX引物1~2μL，所述第一探针混合物包括ERG探针0.1~1μL、SPDEF探针0.1~1μL、MAX探针0.1~1μL的探针；所述第二引物混合物包括IL32引物1~2μL、PDGFA引物1~2μL、SPK引物1~2μL，所述第二探针混合物包括IL32探针0.1~1μL、PDGFA探针0.1~1μL、SPK探针0.1~1μL的探针

S42.将第一反应液、第二反应液注入不同的反应孔中，分别向第一、第二反应液中加入cDNA5~10μL，混匀；

S43.控制PCR条件为：在90~95℃下保持2~5min；再90~95℃3~10s，50~60℃10~20s，70~75℃20~40s，循环35~45次。