[发明专利]一种空肠弯曲菌质谱库建立方法及用途

权利要求书

1.本发明还提供了上述空肠弯曲菌质谱库在空肠弯曲菌检测中的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种空肠弯曲菌质谱库，所述的空肠弯曲菌为CJ1，CJ2，CJ3，CJ4，CJ5，CJ6及各空肠弯曲菌对应的MALIDI-TOF MS质谱图。

所述的空肠弯曲菌质谱库，所述的空肠弯曲菌CJ1，CJ2，CJ3，CJ4，CJ5，CJ6均是从农贸市场购买的三黄鸡中分离获得。

所述空肠弯曲菌质谱库建立方法包括以下步骤：

(1)从禽胴体中分离、鉴定获得的空肠弯曲菌菌株；

(2)向1.5mL的无菌EP离心管中加入300μl超纯水；然后取分离的单个菌落5-8个至离心管中，混合均匀后，再加900μl无水乙醇，混合均匀；

(3)将步骤(2)混合均匀的混合液放入离心机中以12000rpm的转速离心2min,弃去上清；将得到的沉淀在室温下自然干燥5-10min；

(4)灭活后的菌体沉淀中先后加入50μl的70％甲酸和50μl乙腈，充分悬浮，混匀，以12000r/min离心2min提取蛋白，吸取上清液转移置于另一新的无菌离心管中；

(5)移取步骤(4)所述离心管中的上清液1μl置于MALID靶板上，每个样品做2个平行孔，在室温下晾干，然后加上1μlCHCA基质液覆盖样品，室温晾干后上机，进行数据图谱采集；

(6)从哥伦比亚血琼脂平板上挑取大肠杆菌标准菌株ATCC8739涂MALID靶板与样品同一区域的质控孔，立即加1μlCHCA基质液覆盖，在室温下晾干，作为仪器的校准品；

(7)在检测器中放入已点好样品和校准品的靶板，打开LaunchPad软件，选择RuO Mode，进行待测样本的质谱分析，通过SARAMIS(SpectralARchive AndMicrobialIdentificationSystem)Premium软件查看鉴定结果，得到每个样品的指纹图谱；

(8)建立数据库：将步骤(7)得到的指纹图谱进行保存，然后用SARAMIS Premium软件对图谱的质量进行分析。

(9)步骤(8)中所述自建库的建立流程如下：

将获取的菌株质谱从结果(Results)导入质谱库(Spectra)；打开SARAMIS软件，进入登录页面后，显示质谱(Spectra)/结果(Results)窗口，点“Import Spectra to SpectraBase”按钮，结果导入SARAMIS分类树(tree)下的unspecified folder(未指定菌种名称文件夹)。此导入质谱即为参考质谱(Reference spectra)，但尚未指定菌种名称；输入菌种空肠弯曲菌

Campylobacter jejuni所在属名查找该菌种所在属(Campylobacter)，点New并将文件夹名改为新建菌种名Campylobacterjejuni，update tree，完成数据库结构更新；并点击Spectra查找导入数据库的结果；显示导入的结果。点Select All，再点Move To，表示拷贝unspecified folder中选择的Reference Spectra，点all找到新建的Campylobacterjejuni文件夹名，点update Tree。重新上传建库时用的2-3个质谱结果进行验证，等待出现Show Details。未建库前显示No Matches，点Show Details，显示鉴定结果。至此，完成数据库的自建。在此基础上选择需要新建超级质谱的Spectra，然后点CreateSuperSpectrμm编辑按钮，选择菌株共有的峰(consensus spectra)即最特征性的峰保留40个特征峰，保留的40个峰与数据库中所有峰进行比较后，查看Matchs中第一个出现非建库菌种的匹配数，根据这个匹配数查表找到每个峰的权重，从而根据特征性峰的权重之和不大于特征峰数×峰的权重、非建库菌(non-targeted species)匹配数权重之和不大于特征峰数×非建库菌种的匹配数创建超级质谱Super Spectrμm，保存新建的超级质谱文件名。

(10)上述空肠弯曲菌质谱库种属鉴定中的应用。

(11)上述空肠弯菌曲质谱库的建立方法在细菌种属鉴定中的应用。