[发明专利]谷氨酰胺转氨酶交联肽的筛选

说明书

本发明涉及谷氨酰胺转氨酶交联肽的筛选，通过体外RNA展示筛选技术获得了芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转氨酶的八肽交联肽，该交联肽在短肽(八肽)水平上为研究谷氨酰胺转氨酶交联时位点和序列选择倾向性提供了依据，有望提高谷氨酰胺转氨酶的应用水平。

技术领域

本发明属于酶工程领域和食品工程领域，具体涉及芽孢杆菌来源谷氨酰胺转氨酶的交联肽的筛选。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TG)广泛存在于动物、植物以及微生物体内。谷氨酰胺转氨酶可以催化蛋白质分子内和分子间的谷氨酸残基和赖氨酸残基之间形成共价交联，从而改变原始蛋白质的结构和功能性质，被广泛应用于食品加工领域、纺织领域、材料工程与生物医药领域，其中在食品加工领域应用最多。目前的谷氨酰胺转氨酶主要以微生物来源为主，但由于对谷氨酰胺转氨酶在短肽(八肽)水平上的交联过程、位点和序列选择性尚不清楚，且缺乏相关研究，严重制约了该酶的理论改造研究以及应用水平的提高。

本发明工作试图通过mRNA体外展示技术探寻谷氨酰胺转氨酶的交联规律。mRNA体外展示技术，在筛选效能上具有高库容量高灵敏度等优势。其核心技术特征在于，肽库的RNA序列与其翻译的对应氨基酸序列通过连接子(linker)形成了mRNA-linker-多肽融合分子，并用于亲和肽筛选，所获亲和肽序列可以通过共价连接的cDNA的PCR扩增和高通量测序实现超高灵敏度的鉴定。在筛选过程中，mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合，形成mRNA-蛋白质融合体，能在大容量的多肽文库(10¹³～10¹⁵)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白。然而，利用mRNA体外展示技术探寻谷氨酰胺转氨酶交联规律的研究却鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于，通过mRNA体外展示筛选技术，为芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转氨酶筛选多肽类交联肽。

本发明实现目的的技术方案如下：

通过mRNA体外展示方法初筛谷氨酰胺转氨酶的候选交联肽，并通过交联实验的测定验证谷氨酰胺转氨酶交联肽的交联效果，步骤如下：

(1)特殊设计与合成的DNA库，经过体外转录、linker光交联、体外翻译和纯化、反转录等步骤获得基因型表型融合分子库，即mRNA-linker-多肽融合分子库；

(2)通过链霉亲和素磁珠固定生物素修饰的六赖氨酸；

(3)随后将mRNA-linker-多肽融合分子库与磁珠固定六赖氨酸，并加入谷氨酰胺转氨酶进行孵育筛选，筛选获得的亲合肽通过PCR扩增其DNA后进入下一轮筛选。

(4)经多轮筛选最终捕获得到高亲和力的融合分子，并通过PCR扩增和DNA测序实现候选交联肽的序列鉴定。

(5)测定芽孢杆菌来源谷氨酰胺转氨酶对交联肽的交联转化率，确认交联肽的交联效果。