[发明专利]尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

说明书

本发明公开一种尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及在制备维生素B₁₂中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD和突变基因的基因工程菌，其生产维生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体及其编码基因，和在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术

维生素 B₁₂ (VB₁₂)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb 基因来增加细胞生产维生素B₁₂的能力（程立芳等, 不同来源的尿卟啉原 III转甲基酶在脱氮假单胞菌 中的表达及其对生产维生素 B12 的影响. 工业微生物，2017，第 47 卷 第 3期）。

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），可发酵生产维生素B₁₂。而在苜蓿中华根瘤菌中，ALA（5-氨基乙酰丙酸）和尿卟啉原Ⅲ是维生素B₁₂合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB，由基因hemB编码)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC，由基因hemC 编码)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶(HemD，由基因hemD编码)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ（Huan Fang, Jie Kang, Dawei Zhang*. Microbial productionof vitamin B₁₂: A review and future perspectives. Microbial Cell Factories.2017 Jan 30; 16(1):15. doi: 10.1186/ s12934- 017-0631-y.）。目前，尚未有尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD用于维生素B₁₂合成的报道。

发明内容

本发明人对前期筛选出的高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），通过对其进行诱变，获得一株产维生素B₁₂能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B₁₂能力有影响的基因。经过研究发现尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD和突变基因导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B₁₂的能力。