[发明专利]一种设计PCR引物的方法

权利要求书

1.一种设计PCR引物的方法，该方法包括：

a)确定引物长度，以产生足够的模板缔合分数；

b)确定引物3'端结合系数；

c)在折叠影响存在的情况下确定模板缔合分数；

d)通过结合变体等位基因的结合系数，确定引发效率，

其中，模板缔合分数f_a由杂交平衡方程式、质量平衡方程式和热动力学平衡常数方程式导出，所述杂交平衡方程式如下方程式1和5所示，所述质量平衡方程式如下方程式2、3和4所示，所述热动力学平衡常数方程式如下方程式6所示，所述模板缔合分数f_a计算方法如下方程式7所示：

其中，C_t，C_p，和C_c分别表示平衡状态下模板、引物、以及模板-引物复合物的浓度；C_to和C_po分别是起始模板和引物浓度；K_a是平衡常数；T是退火温度；R为理想气体常数；ΔG是自由能，方程式7是来源于假设方程式5和6中的起始模板浓度明显小于起始引物浓度得到的；通过求解方程式5的二阶方程来获得f_a的精确解；将得到f_a值与预定的阈值模板的缔合分数f_a,thr相比，如果f_a小于f_a,thr，特异性区段长度增加1或按预定的数量递增，重复上述计算直到f_a高于f_a,thr，所述f_a,thr至少是0.90，0.91，0.92，0.93，0.94，0.95，0.97，0.98，0.99或更多。