[发明专利]一种提取并纯化聚羟基脂肪酸酯的方法

说明书

聚羟基脂肪酸酯(PHA)的现有提取纯化方法包括有机溶剂或者表面活性剂加水解酶等，过程复杂昂贵。本发明通过对富含PHA的细菌发酵液进行热水或100℃以上过热水处理，完成对细菌细胞的破壁和提纯，并且还可以结合表面活性剂、蛋白酶和/或漂白剂处理等，进一步提高PHA的纯度。本发明成本低廉，操作简单，产品回收率高，而且克服了传统PHA提取步骤繁杂、添加化学物质成本高昂、下游污水难以处理等问题。

技术领域

本发明属于生物工程下游后处理领域，特别是聚羟基脂肪酸酯(PHA)的生产与下游提取与纯化工艺。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一种可以由多种细菌积累的可降解聚酯，根据其单体组成，可分为短链/或中长链PHA，也有均聚物和共聚物。PHA是一种环境友好型材料，有着广泛的应用前景，可以作为传统石油基塑料的环保替代品。其中，聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)是目前PHA家族成员中研究的最为清楚的，但它的应用却受到自身结晶度高、弹性低、柔韧度差等的限制。目前工业上经常使用生物发酵的方法^7,8，来获得富含PHA的细菌，然后进行复杂的提纯工作^3,4,6。

PHA生产是以罗氏真氧杆菌(Ralstonia eutropha)、基因改造的大肠杆菌(E.coli)和嗜盐菌等来进行的。虽然发酵液中菌体富含PHA，但是PHA的提取和纯化除杂工艺很复杂，有些还用到有机溶剂，造成PHA成本昂贵。PHA的性能和其纯度有着非常大的关系。不同的用途对纯度的要求也各不相同。其中，医疗等领域对纯度要求非常高。但是，PHA作为细菌内含物，胞内成分相当复杂，提取纯化难度很大。

已有的提取工艺包括有机溶剂抽提法、机械破碎法、表面活性剂法和多种酶结合的方法等。但都有其局限性：有机溶剂抽提法溶剂回收困难，成本高昂，且操作环境危险，不适合大规模生产；机械破碎法主要包括超声波破壁或者高压匀浆破壁，能耗大，产品损失也很大，纯度低；表面活性剂法的缺点是表面活性剂对PHA分子量破坏严重，且含有表面活性剂的废水处理难度大，加上表面活性剂的残留等^2-5。

CN1070534C公开了一种从细菌菌体内分离提取PHA的方法，包括如下步骤：1)用含有表面活性剂的碱性溶液处理菌体；2)固液分离，分离出去大部分非PHA成分；3)用碱性蛋白酶处理PHA；4)分离提取PHA颗粒；5)干燥得到PHA产品。该方法反应条件温和，但是耗碱量大，表面活性剂添加量大，额外地增加了成本和污水处理成本，在工业化放大过程中有着明显的。

CN1211489C公开了一种从细菌菌体内分离提取PHA的方法，包括用有机溶剂五和/或四碳醇中的一种或几种破坏细胞壁并提取PHA。

CN109575264A涉及一种以有机溶剂戊内酯为溶剂提取PHA的方法。

CN109504715A公开了一种制备PHA的方法，包括加入阴离子表面活性剂(SDS)进行菌体细胞壁破壁裂解的步骤。

现有的所有上述方法都涉及有机溶剂和/或表面活性剂的使用，具有提取步骤繁杂、添加化学物质成本高昂、下游污水难以处理等问题。

因此，开发一种简单有效的PHA下游提取纯化工艺对降低PHA生产成本至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，该方法是从PHA生产菌发酵液中高效低成本的提取PHA的工艺方法，该方法工艺温和，成本低廉，对设备要求低，可实现大规模工业化生产。

本发明人出人意料地发现，通过单独用热水、特别是过热水处理生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物菌体，可以获得菌体破壁裂解液，而避免了有机溶剂和/或表面活性剂的使用，从而克服了传统PHA提取步骤繁杂、添加化学物质成本高昂、下游污水难以处理等问题。