[发明专利]利用荧光信号差值测量斑马鱼心率的方法

说明书

一种对生物体损害更小、更稳定、更精确的非接触式斑马鱼心跳频率的测量方法。基因标记的斑马鱼心脏中的GFP荧光蛋白对应激发波长的激光照明后，会发出荧光信号。利用搭配滤光片的倒置式显微镜滤除激发光的信号(488nm)采集荧光信号(507nm)，并且利用高速CCD相机采集一段时间内的心跳图像形成一个视频。将得到的视频逐帧提取并对帧与帧之间的差值区域面积进行统计绘图，得到差值随时间的变化曲线。通过统计波峰出现的平均间隔帧数和波谷出现的平均间隔帧数的平均值得到心脏跳动周期，利用已知的视频帧率即可求得心跳的频率。该方法在生物测量、生物活体显微成像等方面有重要的应用潜力。

技术领域

本发明属于光学、生物测量技术领域，涉及微光学器件加工、显微成像系统设计以及 生物活体成像。其特点是使用逐帧做差的方法提取心脏跳动的信号，能较完整的复原心脏 跳动。

背景技术

斑马鱼由于其发育迅速，透明度较高等特点被广泛应用于生物实验中，其心率的测量 在生物实验以及相关的药物研究方面起着重要的作用。目前测量斑马鱼心率的方法有以下 几种。

一、针刺法测量斑马鱼的心电图：该方法是将两个电极刺入斑马鱼的心脏检测电信号， 经过放大处理后得到斑马鱼的心电图。该方法对斑马鱼的损害较大，对于未成年的斑马鱼 也无法测量，且电极的刺入会导致心脏频率的改变。

二、利用CCD相机拍摄的测量方法：该方法是直接用CCD相机拍摄斑马鱼的心脏区域，利用后续图像处理的方法求出各帧图片之间的相关性来评价斑马鱼的心跳。该方法对生物体的影响较小但是应用条件较为复杂，对成像质量的要求较高并且无法得到精确的斑马鱼心跳信号。

三、绿色荧光蛋白的标记方法：该方法使用绿色荧光蛋白标记斑马鱼的心脏，一般利 用共聚焦显微系统或者其他荧光显微系统测量斑马鱼的心率。该方法未提供较好的后期处 理的相关技术。

目前存在的方法难以提高测量的精度，本发明在算法上做出改进，可以得到更多心跳 信号的细节。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对生物体损害更小，更稳定，更精确的非接触式斑马鱼心 跳频率的测量方法。

斑马鱼心脏中的荧光蛋白对应激发波长的激光照明后，会激发出荧光信号。利用搭配 滤光片的倒置式显微镜滤除激发光的信号(488nm)采集荧光信号(507nm)，并且利用高速 CCD相机采集一段时间内的心跳图像形成一个视频。

将得到的视频做后续处理：首先利用自主编写的程序将视频逐帧提取为图片并得到视 频的帧率(fps)，仅提取视频中绿色通道进一步减少激发光的影响。选取适当的灰度阈值 对所有图片进行二值化处理，阈值选取时需考虑既不影响心脏细节又能有效的去除心脏之 外的其他信号。选取某一帧f₀作为初始图像，后续每一帧f_i对初始帧做差，对帧与帧之间 的差值区域面积f_i-f₀进行统计绘图，每一帧与初始帧的差值作为心脏状态的表征。当第 i帧与初始帧的差最小时认为进行了一个完整的周期，得到差值随时间的变化曲线。寻找 到上述曲线中的波峰坐标和波谷坐标，去除干扰的次级波峰，统计波峰出现的平均间隔帧 数T_p和波谷出现的平均间隔帧数T_v，二者求平均值得到心脏跳动周期，利用已知的视频帧 率即可求得心跳的频率。