[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备环孢霉素A检测试剂中的用途

说明书

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备环孢霉素A检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变或其组合：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

本申请要求2019年1月9日提交的申请号为201910017764.4和2019年5月21日提交的申请号为201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在环孢霉素A检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

环孢霉素A(Cyclosporine A，CsA)结构式如下所示：

环孢霉素A是由真菌(多孢木霉菌或柱孢木霉菌)分泌的多种氨基酸组成的脂溶性环形肽。CsA作为具有高选择性和超低骨髓毒性的免疫抑制剂，可选择性抑制T辅助淋巴细胞的增殖和释放，同时该药物具有抗真菌活性，可有效降低患者感染情况。环孢霉素A在器官和组织移植、血液病和眼科疾病等方面具有重要临床应用价值，在器官和组织移植方面，可预防同种异体肾、肝、心、骨髓等器官或组织移植所发生的排斥反应，也可预防及治疗骨髓移植时发生的移植物抗宿主反应；在血液病方面，可应用于再生障碍性贫血、红细胞再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、自身免疫性溶血性贫血等疾病；在眼科疾病方面，主要用于白塞氏综合征、干眼症、巩膜炎、过敏性结膜炎等疾病。

环孢霉素A作为钙调磷酸酶抑制剂常用药物，已成为很多难治性肾病治疗和器官移植的重要选择之一，主要分布在除大脑外的人体组织中，在血液中主要分布在红细胞和血浆中。环孢霉素A主要由肝脏代谢，已知代谢产物15种，消除半衰期10-27小时左右，代谢物主要由胆汁经粪便排泄，尿中仅0.1％以原药形式排出。

然而，由于该药物安全范围窄、代谢影响因素复杂，在药动学和药效学上存在着明显的个体差异，且血药浓度与给药量间相关性不佳，给临床治疗增加了难度，易产生肾毒性、多毛症、牙龈增生等不良反应以及不良反应个体化差异严重等问题。

基于上述原因，在治疗过程中需及时进行环孢霉素A血药浓度监测，是辅助临床治疗、改善治疗效果、降低毒性风险的有效方式。

目前已知的环孢霉素A检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法。HPLC法需要复杂的样品前处理，操作复杂周期长且成本昂贵；发光免疫法试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物检测，更不利于大范围推广。

现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。