[发明专利]检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。含有新城疫病毒RNA片段的待测物通过利用该引物和探针可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术在等温条件下进行大量扩增，操作简单，所需时间短，特异性好、灵敏度高的优点。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。

背景技术

新城疫(Newcastle Disease，ND)又名伪鸡瘟，是由新城疫病毒(NDV)感染引起的以消化道和呼吸道为主要传播途径的一种禽类急性、高度接触性传染病，传播速度快，一年四季均可发病，对世界范围内的禽类养殖业危害极大。NDV主要感染禽类，一般鸡最常见，雏鸡最易感。患病鸡临床表现为体温上升、呼吸急促、咳嗽、排黄绿色甚至灰白色水样粪便，产蛋鸡产蛋率下降，软壳蛋比例增加，即使恢复后也会对鸡的生长发育有影响，因此给养殖业带来严重的经济损失。

ND的临床症状与低致病性禽流感、传染性喉气管炎、传染性支气管炎等相似，都表现为呼吸困难，临床诊断容易混淆。目前，国内外已经建立多种NDV检测方法，血清学的方法包括血凝血抑试验、琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光试验、免疫组化技术、酶联免疫吸附试验等，分子生物学诊断方法包括：常规PCR、实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)、环介导等温核酸扩增技术等。其中，以PCR和RFQ-PCR是最常规的临床检测方法，但二者均需要昂贵的PCR仪，且所需的检测时间较长，对操作人员有较高的技术要求。

发明内容

针对现有PCR和RFQ-PCR所需的检测时间较长、对操作人员技术要求较高的问题，本发明提供了用于检测新城疫病毒的引物和探针组合。

以及，本发明还提供了一种检测新城疫病毒的试剂盒。

以及，本发明还提供了检测新城疫病毒的方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

用于检测新城疫病毒的引物和探针组合，所述引物的序列(如SEQ ID NO.1～2所示)为：

上游引物：5′-ACGTCTTTATTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGA-3′；

下游引物：5′-TGATTACCTAAGTCCTTTGCCAGAGCATCTACT-3′；

所述探针的序列(如SEQ ID NO.3所示)为：5′-AAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTA-THF-TGATGTATGCGGATA-3′。

含有新城疫病毒RNA片段的待测物利用上述引物可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)在等温条件下进行大量扩增，不需对NDV模板反转录，操作简单，在23min内即可完成目的基因片段的扩增。其最低检测限可达到100拷贝/μL，是常规PCR法(10³拷贝/μL)灵敏度的10倍。同时对其他类症禽病病原体核酸无交叉反应，表现良好特异性。

其探针基于上述下游引物而设计，探针上距离5′端30bp位置有一个碱基缺口，并以四氢呋喃(THF)残基修饰(SEQ ID NO.3中R即为THF)，当探针为单链时核酸内切酶不识别，只有当探针和上述引物扩增所得的扩增产物中的目的片段结合后核酸内切酶才开始工作，从而可提高该检测方法的特异性，使其他病毒对检测结果无干扰。

以及，本发明实施例还提供了一种检测新城疫病毒的试剂盒，包含上述引物和探针组合。使用该试剂盒进行新城疫病毒的检测对检测设备和操作人员要求低，操作简便，检测成本低，并具有特异性好、灵敏度高的优点。

优选地，所述探针5′端以荧光基团修饰，所述下游引物的5′端以生物素修饰，扩增完成后可通过侧向流试纸条进行现场检测，从而能够简便、快捷地诊断新城疫病毒。