[发明专利]番茄黄化曲叶病毒分离物TYLCV-BJ及侵染性克隆构建方法和应用

权利要求书

1.一种番茄黄化曲叶病毒分离物TYLCV-BJ，其特征在于：全基因组序列如序列表中SEQID NO:2所示。

2.一种菌株，其含有权利要求1所述的番茄黄化曲叶病毒分离物TYLCV-BJ。

3.根据权利要求2所述的菌株，其保藏号为CGMCC NO.19119，保藏日期：2019年12月9日。

4.权利要求1所述番茄黄化曲叶病毒分离物TYLCV-BJ的侵染性克隆构建方法，其特征在于：将1.4个串联重复的TYLCV-BJ基因组序列构建到pCambia2300载体上。

5.根据权利要求4所述的番茄黄化曲叶病毒分离物TYLCV-BJ侵染性克隆构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)使用限制性内切酶EcoRI与BamHI酶切T-TYLCV-BJ-DNA，获得约1.2kb的DNA片段，大约为基因组的0.4拷贝；连接到EcoRI与BamHI酶切后的pCambia2300载体上；将重组载体pCambia2300-TYLCV-BJ-0.4转化到大肠杆菌DH5a中，使用引物：

TYLCV-BJ-EcoRI-F与TYLCV-BJ-BamH-R筛选阳性克隆；TYLCV-BJ-EcoRI-F与TYLCV-BJ-BamH-R如SEQ ID：No.5-6所示；挑选阳性克隆，进行培养；提取培养目标克隆的质粒；通过DNA测序进行验证；

TYLCV-BJ-EcoRI-F：GAATTCCTTGAAGTGCTTTAAATAATG

TYLCV-BJ-BamH-R：AAGTGGATCCCACATAGTGCAAGAC

(2)使用限制性内切酶BamHI酶切T-TYLCV-BJ-DNA，回收约2.7kb的DNA片段，为基因组的1个拷贝,；将BamHI酶切的2.7kb左右的DNA片段连接到BamHI酶切pCambia2300-TYLCV-BJ-0.4DNA载体上，将重组载体pCambia2300-TYLCV-BJ-1.4DNA转化到大肠杆菌DH5a中，使用以下引物：TYLCV-BJ-FW-F与TYLCV-BJ-FW-R筛选阳性克隆；TYLCV-BJ-FW-F与TYLCV-BJ-FW-R如SEQ ID：No.7-8所示；挑选阳性克隆，进行培养；提取培养目标克隆的质粒；通过DNA测序进行验证；验证成功后，将其导入农杆菌EHA105菌株中；

TYLCV-BJ-FW-F：ACTGCCTGAATTGAGTGCC

TYLCV-BJ-FW-R：GTACCGGAAGCCCAGAATATAC。

6.权利要求5所述的构建方法获得的pCambia2300-TYLCV-BJ-1.4DNA重组质粒。

7.权利要求6所述的重组载体pCambia2300-TYLCV-BJ-1.4DNA在分析TYLCV-BJ病毒的致病性、作为毒源筛选抗病毒的番茄品种及抗病毒的拟南芥突变体中的应用。