[发明专利]一种以D-甘油醛为受体合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖的方法

说明书

本发明公开了一种D‑甘油醛的生产方法，其通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D‑甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明获得了天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶AldO的氨基酸序列，通过密码子优化，并将其表达在大肠杆菌细胞中。该酶能够将廉价的甘油转化为D‑甘油醛，并且具有很好的催化效率，反应条件温和，操作简单，这对通过基因重组合表达技术的大规模工业化应用生产十分有利。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种以D-甘油醛为受体合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

甘油醛(glyceraldehyde)是一种最早发现的具有光学活性的醛糖化合物，根据其光学活性不同可分为D-甘油醛和L-甘油醛。甘油醛能够作为多种糖类化合物合成的重要前体，比如磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)能够以D-甘油醛为受体，合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖；D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0 .3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等生理功能。2011年美国FDA已经批准D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用，自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展，市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品，2012年松谷化学在日本国内发售添加有13％～15％比例的D-阿洛酮糖、阿洛糖等3种以上的稀少糖糖浆产品(Rare-sugar sweet(简称RSS))，受到消费者欢迎。甘油醛的制备方法有化学法和生物法。但是，由于生物法报道较少，目前市场上销售的D-甘油醛大部分是通过化学方法生产而来。相比生物法，化学方法具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点。利用生物法生产甘油醛，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此越来越受到关注。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种D-甘油醛的生产方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种D-甘油醛的生产方法，其包括，通过糖醇氧化酶AldO将甘油转化为D-甘油醛，所述糖醇氧化酶AldO，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：包括，将重组质粒pET28a-AldO转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，制备得到AldO的表达菌株。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：还包括，在含卡那霉素的LB培养基平板上划线，次日挑取单菌落接种于5mL含卡那霉素的 LB培养基，37℃，200rpm过夜培养，以1％的接种量接入50mL LB培养基中， 37℃，200rpm继续培养2～3h；待培养物OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，16℃，200rpm过夜培养，6000rpm离心收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤，用5mL无菌水重悬菌体，超声破碎，12000rpm离心收集上清液，用镍柱进行纯化。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述卡那霉素终浓度为50μg/mL。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其适宜反应温度为25～45℃。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为30～40℃。

作为本发明所述的D-甘油醛的生产方法的一种优选方案：所述糖醇氧化酶AldO，其最适反应温度为35℃。