[发明专利]热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用

说明书

本发明提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用。本发明通过对热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌进行基因工程改造，引入ribC(G199D)点突变，并依次敲除purR、purA、ccpN、ldh基因，然后向改造后的工程菌中导入携带有核黄素合成基因簇的表达载体而构建得到一系列高温产核黄素的地芽孢杆菌工程菌。经测定，经过基因工程改造后的地芽孢杆菌发酵24h核黄素产量为520mg/L；通过对菌株进行葡萄糖和木糖进行混合发酵，产量可以达到1g/L以上。本发明提供的工程菌具有生长温度高，代时短，可利用廉价碳源等优点，可以低成本地用于核黄素的大规模生产。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用。

背景技术

核黄素，即维生素B2，是细菌和动物必需的维生素之一，在生物体内通常以FMN和FAD的形式存在，参与细胞内氧化还原反应。它主要应用在制药，饲料添加剂，食品添加剂和化妆品等领域，目前，核黄素生产工艺是微生物发酵法。在早期其生产菌株为真菌，像解朊假丝酵母(Candida famata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)等(Stahmann et al，2016，Appl Microbiol Biotechnol 100：2107-2119)。但由于真菌生产核黄素存在着一些问题，例如发酵周期长(6-7天)、产量较低(小于5g/L)、原料成分配比复杂、菌体粘度大、后期分离困难、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素合成等。随后，又开发了以细菌为宿主菌的基因工程菌。这些基因工程菌的原料要求简单、产量高、成熟的原核细胞基因工程技术等优点，迅速替代了利用真菌的生产技术。目前，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过遗传改造成为主要的核黄素工业生产菌(Susanne et al，2016，Appl Microbiol Biotechnol100：2107-2119)，但其生产过程属于常温发酵。

枯草芽孢杆菌发酵生产属于常温发酵，与热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌的高温发酵相比，发酵生产核黄素具有明显的劣势：一是能耗高。首先在常温发酵生产过程中需要大量的冷却水来缓解发酵过程的生物热，以维持常温发酵过程中生产菌种的最适生长温度，常温发酵过程中冷却水的耗费约占生产成本的30％，而高温发酵可以减少甚至不使用冷却水。其次设备原料等高温灭菌冷却时间较少，节能节水。二是生产周期长，枯草芽胞杆菌生长代时达40-120min。热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌代时最快可达16min，比枯草芽孢杆菌的代时要短。因为地芽孢杆菌生长速度快相应的细胞内酶的反应速率提高，合成核黄素的酶反应速度快就可以更快的生产核黄素。三是专利壁垒明显，枯草芽孢杆菌生产核黄素的专利大多被国外大公司掌握，对国内枯草芽孢杆菌的研究与应用造成困扰。四是原料较贵。热葡糖苷酶地芽孢杆菌可以利用更廉价的碳源木质纤维素水解物，比枯草芽孢杆菌发酵过程中使用葡萄糖等原料更便宜；五是简化发酵工艺。枯草芽孢杆菌等常温菌生产核黄素是37℃发酵，而大量的杂菌都能在37℃条件下生长导致发酵过程中很容易染菌。然而，很少有杂菌能在50℃以上的温度下生长，因此地芽孢杆菌的高温发酵是一道天然防止杂菌染菌的屏障，不需要投入大量的设备来防止发酵过程中染菌，简化发酵工艺。因此，与枯草芽孢杆菌工程菌相比，嗜热菌地芽孢杆菌具有独特的优势和应用价值。因此，开发核黄素高温生产工艺是未来核黄素工业发展的方向。

发明内容

本发明的目的是提供热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌工程菌及其构建方法及应用。