[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备雷帕霉素检测试剂中的用途

说明书

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备雷帕霉素检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变或其组合：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

本申请要求2019年1月9日提交的申请号为201910017764.4和2019年5月21日提交的申请号为201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在雷帕霉素检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

雷帕霉素(Rapamune)结构式如下所示：

雷帕霉素(也称为西罗莫司，siro)是由放线菌合成的疏水大环类三烯内酯，是亲脂性分子家族中的一员。其携带有内酯环，12-，14-或16-位被羟基、甲基、或乙烷基取代。雷帕霉素与环胞霉素、糖皮质激素联合使用时，可以降低肾移植受体急性排斥反应的发生率。原因在于雷帕霉素与他克莫司结合蛋白-12结合，而抑制T淋巴细胞的增值。

雷帕霉素分布于人红细胞中，由肝脏代谢，通过粪便和胆汁清除。雷帕霉素的副作用有头痛，恶心，头晕，鼻出血，关节疼痛；实验室检查发现如下指标异常：血小板、白细胞减少，高甘油三酯血症，高胆固醇血症等。以上副作用为剂量依赖性，并且为可逆的。

基于上述原因，在治疗过程中需及时进行雷帕霉素血药浓度监测，是辅助临床治疗、改善治疗效果、降低毒性风险的有效方式。

目前已知的雷帕霉素检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法。高效液相色谱法可将药物与代谢产物以及内源性物质分离，具有专一性强的特点，是检测MTX血浆浓度的金标准，但该法需复杂的前处理过程和较长的测定时间，不适合大样本的快速检测。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。

均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH-雷帕霉素)与非标记抗原(雷帕霉素)，竞争与定量的抗体(雷帕霉素抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中雷帕霉素的含量。

现有的均相酶免疫测定法依赖于对小分子药物自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的策略难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。

发明内容