[发明专利]一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，试剂盒，包括：融合蛋白‑抗原‑抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA‑2a抗体，IA‑2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA‑512抗体；制备方法通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，再利用细胞转化得到荧光素酶—抗原融合蛋白；再通过裂解基因重组细胞，纯化，捕捉获得融合蛋白‑抗原‑抗体复合物；再加入荧光素酶底物，检测荧光强度；本发明通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。

技术领域

本发明涉及自身免疫检测领域，特别是一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

I型糖尿病(IDDM)是一种自体免疫疾病，机体受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素诱发而产生异常自身体液和细胞免疫应答，导致胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少，一旦发病需要依赖外源性胰岛素补充以维持生命，所以I型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病。对I型糖尿病的诊断主要通过检测其自身免疫性抗体，抗体主要包括以下几种：谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)、酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2a、IA-2b)及胰岛素自身免疫性抗体(IAA)。

现有的Ⅰ型糖尿病自身免疫检测方法如下所述：

ICA(抗胰岛细胞抗体)：①间接免疫荧光法；②组织化学染色法；③免疫沉淀化学法；④ELISA法。

GAD(谷氨酸脱羧酶抗体)：①免疫沉淀酶活性法；②放射免疫法；③ELISA法；④间接免疫荧光法；⑤化学发光法。

ICA 512/IA2ab(抗酪氨酸磷酸酶抗体)：①ELISA法；②放射配体分析法(RLA)；③³⁵S标记的放射免疫沉淀法。

IAA(抗胰岛素自身抗体)：①放免法；②ELISA法。

但是现有的检测方法具有如下问题：ELISA法：对于酶的活性和灵敏度要求很高，其特异性取决于抗原制备的优劣；且其结合物制备尚未标准化，这使得实验结果的可重复性不高，需要进行多次检测。另外，若抗原及酶结合物浓度低，最后吸光度值太小，易出现假阴性。多数国家的临床检测已放弃ELISA法，使用放射免疫法(RIA法)。放射免疫法：具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，并且样品用量少，常可测至皮摩尔量。但本方法有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐，有时会影响结果等。

市场需要一种对Ⅰ型糖尿病的诊断有高特异性和高敏感性的检测试剂盒，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。

前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。