[发明专利]一种鼻粘膜类器官培养基及培养方法有效
申请号: | 202010019555.6 | 申请日: | 2020-01-08 |
公开(公告)号: | CN111117946B | 公开(公告)日: | 2022-03-22 |
发明(设计)人: | 李刚;汪珂;王显文 | 申请(专利权)人: | 南方医科大学南方医院 |
主分类号: | C12N5/071 | 分类号: | C12N5/071 |
代理公司: | 佛山市神机营专利代理事务所(普通合伙) 44765 | 代理人: | 许尤庆 |
地址: | 510000 广东*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 粘膜 器官 培养基 培养 方法 | ||
1.一种鼻粘膜类器官培养基,其特征在于,培养基的成分及其含量如下:不含Vit-A的B27,1X;N-acetylcysteine,1mM;EGF,50ng/ml;Noggin,100ng/ml;R-spondin 1,250ng/ml;Wnt3a,250ng/ml;A83-01,500nM;Nicotinamide,10mM;Y-27632,10μM;Glutamax,1X;Gastrin,5nM;SB202190,10μM;青霉素链霉素混合液,1X;wnt7a,10ng/ml;IL-6,50ng/ml;HEPES,1mM。
2.一种鼻粘膜类器官培养方法,其特征在于,将鼻粘膜组织预处理得到细胞沉淀,将细胞沉淀加入至含有混合胶原溶液的transwell小室内皿中,凝固成凝胶;在transwell小室外皿中加入权利要求1的培养基,恒温培养;
所述混合胶原溶液由如下组分配制而成:A.鼠尾I型胶原蛋白,B.1X浓缩无菌培养基DMEM,C.Advanced DMEM/F12,D.1mol/L无菌NaOH溶液。
3.根据权利要求2的方法,其特征在于,培养组织来源包括鼻甲、鼻中隔、鼻底、嗅区、鼻窦、鼻咽部,预处理步骤包括洗涤、切碎、消化、裂解步骤。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,预处理步骤具体为:鼻粘膜组织采用含2%双抗的Hanks液洗涤后,将组织切碎;加入消化酶I消化,离心弃上清,再加入消化酶II消化,离心弃上清,Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀,过滤得到含有鼻粘膜单细胞的滤液,离心弃上清,加红细胞裂解液裂解,离心弃上清得细胞沉淀;消化酶I包括collagenasetypeIII、透明质酸酶、Insulin和EGF;消化酶II包括TrypLE Express和DNaseI酶。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,混合胶原溶液的配制方法如下:先将100μlB与1mlC混合,再加入875μlA,最后加入15μlD,得到混合胶原溶液。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法,其特征在于,还包括更换培养基步骤:每间隔2-3天更换一次培养基,更换的培养基同权利要求1的培养基。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,更换的培养基为条件培养基。
8.根据权利要求2-5任一项所述的方法,其特征在于,还包括传代步骤:将内皿中含有细胞的混合胶原转移至15ml离心管,加入100Unit/ml胶原酶IV在37℃下解离15-20分钟,每30天对类器官进行1:2传代。
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