[发明专利]检测Botryosphaeria sinensia的LAMP引物及试剂盒

说明书

本发明提供一套检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的LAMP引物及试剂盒。所述LAMP引物包括外侧正、反向引物以及内侧正、反向引物，它们的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑4所示。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于Botryosphaeria sinensia病菌的快速检测，可从发病植物组织及苗木中复杂的病原菌环境准确地检测出该致病菌。该方法的特异性、灵敏度及可重复性均较常规PCR方法更高，对Botryosphaeria sinensia早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可避免高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种检测Botryosphaeriasinensia的LAMP引物及试剂盒。

背景技术

葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaericeae)侵染引起的蓝莓茎溃疡病(BlueberryStem Blight)，目前在我国主要蓝莓产区已有发生报道，对中国蓝莓产业健康发展带来严重危害。该菌从蓝莓植株的伤口或自然孔口进行侵染，导致皮层和韧皮部的枯死在田间引起蓝莓枝条枯萎、木质部坏死及植株死亡等症状。目前，葡萄座腔菌科中已有多种能引发此病害(Botryosphaeria cortices，Botryosphaeria dothidea，Botryosphaeria sinensia，Fusicoccum aesculin，Lasiodiplodia chinesis，Lasiodiplodia theobromae，Lasiodiplodia vaccinii，Neofusicoccum arbuti，Neofusicoccum austral，Neofusicoccum parvum，Neofusicoccum ribis)，其中Botryosphaeria sinensia是一种强致病菌，病部皮层组织变软变黑，易剥离，可在蓝莓枝条表面形成红棕色至黑色病斑，组织坏死，可见椭圆状至不规则形状褐色溃疡病斑，蔓延至整个枝条，引起整枝枯萎死亡，该菌主要在枝条病斑内越冬，在适宜条件下产生分生孢子，借助通过自然孔口或机械伤口侵入田间植株，侵染后，菌丝迅速扩展到维管组织，通过细胞间隙横向发展，最终，在愈伤组织、皮层、木质部、管胞或导管等各种类型的细胞中定殖。该菌有潜伏侵染的特性，通常作为腐生菌在土壤中或植物内生菌在健康的植株中存在，当遇到高温、积水、风害等逆境条件时便开始侵染植株。因此，对该类病菌的初侵染源早期进行适时监控，对于该病害的防控有重要意义，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。

普通PCR技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于基层推广。自环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测研究。LAMP技术作为一种恒温核酸扩增技术，其最大的优点在于反应速度快、设备简单，而且结果易于鉴定，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前尚未见利用LAMP技术检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的LAMP引物及试剂盒。

本发明的另一目的是提供基于LAMP技术的蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeriasinensia)检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的LAMP引物，所述LAMP引物为(SEQ ID NO：1-4)：

外侧正向引物F3：5’-AAGATCGACCGCCGTACC-3’；