[发明专利]一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体

说明书

本发明涉及一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体，所述的突变体为：在如SEQIDNO.1所示的野生型AtPRK蛋白的序列基础上，突变了如下位点形成的突变体：(1)D14A、S15A、K19A、S20A、W156A中的任一或任意组合；(2)D58A、H61A、R65A、R68A、K69A、Y104F、H106A中的任一或任意组合；或(3)上述两组突变位点的任意组合；其中第(1)组突变涉及ATP亲和力的变化，第(2)组突变涉及Ru5P亲和力的变化。本发明还涉及所述的突变体的应用，(1)构建改变卡尔文循环(暗反应阶段)功能的模型植株；(2)构建植物模型；(3)构建具有改进的固碳功能的植株；(4)催化5‑磷酸核酮糖(Ru5P)为1，5‑二磷酸核酮糖。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一组拟南芥磷酸核酮糖激酶的突变体。

背景技术

光合作用是地球上最为重要的物理化学反应之一，光合生物利用光能将二氧化碳和水转换为碳水化合物。放氧光合生物，如蓝藻，绿藻和高等植物等还能释放出氧气。光合作用分为光反应阶段和暗反应阶段，其中光反应是严格依赖于光的，而暗反应不需要光也能进行。在光反应阶段中，光系统吸收光能，在反应中心裂解水释放出氧气、质子和电子，同时生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和三磷酸腺苷(ATP)。在暗反应阶段，光合生物利用光反应阶段产生的NADPH和ATP，固定二氧化碳，合成糖类，这是一个由多个酶参与的多步催化反应过程，被称为卡尔文循环。虽然卡尔文循环不依赖光，但是需要光反应过程中生成的ATP和NADPH，所以卡尔文循环的进行也受到“光照/黑暗”转换的调控，这一过程主要通过叶绿体类囊体基质中的氧化还原状态变换来调节的。参与卡尔文循环的11个酶中有4个是受到氧化还原调控的，还原态是它们的活性形式，氧化态则是失活状态。在光照条件下，光系统I(PSI)激活“铁氧还蛋白-硫氧还蛋白”氧化还原系统，还原叶绿体中的硫氧还蛋白(TRX)。还原态的硫氧还蛋白可以继续还原并激活卡尔文循环中的酶，其中磷酸核酮糖激酶(PRK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)都受其调控。此外，叶绿体中的一个小蛋白叶绿体蛋白12(chloroplast protein 12，CP12)，作为卡尔文循环调控的中心，也受到硫氧还蛋白的调控。

暗反应阶段通常被分为三个过程：二氧化碳固定，三碳糖还原和五碳糖再生。PRK在五碳糖再生过程中起作用。在此过程中，PRK消耗光合作用光反应的产物ATP，将其γ-磷酸基团转移到5-磷酸核酮糖(Ru5P)上，催化生成1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)及二磷酸腺苷(ADP)。RuBP作为固定二氧化碳的酶Rubisco的底物，起始光合作用的二氧化碳固定过程。关于PRK结构和催化机制的研究早在1998年就有报道，但这些研究都是基于非放氧光合细菌紫细菌来源的PRK(Rhodobacter spheaeroides PRK，RsPRK)进行的。放氧光合生物来源的PRK与RsPRK在蛋白序列上的同源度极低，只有17.1％，并且它们的寡聚状态和调控方式方面也截然不同。RsPRK形成同源八聚体，而来源于放氧光合生物的PRK一般以同源二聚体形式存在。且在每个单体中，N端都含有一对受氧化还原调控的半胱氨酸，处于还原态的PRK为活性状态，氧化态的PRK为失活状态；而RsPRK中没有这对半胱氨酸，因而不受氧化还原调控。最近，有研究揭示了蓝藻PCC 6301的氧化态PRK结构，以及拟南芥和莱茵衣藻的还原态PRK结构。这些结构说明了放氧光合生物PRK的二体形成形式以及受氧化还原调控的半胱氨酸的位置。在还原态PRK中，两个半胱氨酸分开较远距离，氧化态PRK中两个半胱氨酸形成了二硫键。在激酶中，通常包含一段相对保守的motif，由序列G-x(4)-GK-[TS](Gly-任意四个氨基酸-Gly-Lys-Thr或Ser)组成，这段序列被称为P-loop，通常参与激酶中的ATP结合。在PRK中，一个半胱氨酸(C17)正位于P-loop结构域，当与另一个半胱氨酸(C56)形成二硫键后，可能破坏了PRK中ATP的结合位点，从而导致氧化态PRK失去活性。