[发明专利]一种NK细胞体外大规模诱导扩增培养方法

说明书

本发明公开了一种NK细胞体外大规模诱导扩增培养方法，包括以下步骤：采集外周血并分离外周血单个核细胞；将细胞接种至包被CD16和CD137L激活抗体的培养瓶中；加入无血清淋巴细胞培养基于细胞培养瓶内，使细胞密度为2‑4*106个/ml，此时种板为day0，将诱导因子加入到无血清淋巴细胞培养基中；培养4d后加入补充无血清淋巴细胞培养基，将激活因子加入到无血清淋巴细胞培养基中；培养9d后加入补充无血清淋巴细胞培养基，将扩增因子加入到无血清淋巴细胞培养基中。本发明可以达到完全无血清培养，操作方案操作较为简单，成本较低，得到的NK细胞在细胞活性，纯度，细胞数量以及杀伤活性方面具有显著优势。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，尤其涉及一种NK细胞体外大规模诱导扩增培养方法。

背景技术

NK细胞，又叫自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)，是机体内重要的免疫细胞。现在人们由于不良生活习惯、工作压力、环境因素等的变化，伴随着机体免疫力下降，NK细胞数量逐渐减少，活性减弱，导致了“幸存”下来的癌细胞越来越多，而且会慢慢适应机体的免疫环境，并开始急剧增长。强化自身软弱的NK细胞，提高机体NK细胞数量，增强其活性，清除机体内衰老和癌变细胞，使其回到年轻健康的状态，这就是“NK免疫疗法”，而如何在体外获得大量活化的NK细胞是临床应用NK细胞免疫疗法的关键，日本在该行业走在前列，目前国内大部分医疗或美容机构采用日本技术在体外扩增NK，这也是NK免疫疗法收费昂贵的原因之一。国内NK扩增技术培养的效果均逊于日本技术，体外培养出的活化NK细胞量不够大，不够高效。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种NK细胞体外大规模诱导扩增培养方法。

本发明提出的一种NK细胞体外大规模诱导扩增培养方法，包括以下步骤：

S1：采集外周血并分离外周血单个核细胞；

S2：将细胞接种至包被CD16和CD137L激活抗体的培养瓶中；

S3：加入诱导培养基于细胞培养瓶内，使细胞密度为2-4*106个/ml，此时种板为day0，将诱导因子加入到无血清淋巴细胞培养基中即配置成诱导培养基；

S4：培养4d后加入激活培养基，将激活因子加入到无血清淋巴细胞培养基中即配置成激活培养基；

S5：培养9d后加入扩增培养基，将扩增因子加入到无血清淋巴细胞培养基中即配置成扩增培养基。

优选地，所述诱导因子记为NKGrow3，NKGrow4和NKGrow5，所述NKGrow3为细胞因子IL-2，浓度为10-100ng/ml，所述NKGrow4为细胞因子IL18，浓度为10-50ng/ml，所述NKGrow5为细胞因子IL15,浓度为10-100ng/ml。

优选地，所述激活因子记为NKGrow6和NKGrow7，所述NKGrow6为细胞因子IL-15，浓度为10-100ng/ml，所述NKGrow7为细胞因子IL21，浓度为10-50ng/ml。

优选地，所述扩增因子记为NKGrow8，所述NKGrow8为细胞因子IL-2，浓度为10-100ng/ml。

优选地，所述NKGrow3为细胞因子IL-2，浓度为50ng/ml，所述NKGrow4为细胞因子IL18，浓度为25ng/ml，所述NKGrow5为细胞因子IL15,浓度为50ng/ml。

优选地，所述NKGrow6为细胞因子IL-15，浓度为50ng/ml，所述NKGrow7为细胞因子IL21，浓度为25ng/ml。

优选地，所述NKGrow8为细胞因子IL-2，浓度为50ng/ml。

优选地，所述无血清淋巴细胞培养基为AlyS505NK培养基或XVIVO500培养基。