[发明专利]一种多重荧光定量PCR试剂盒

权利要求书

1.一种多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括：第一反应体系试剂、第二反应体系试剂和第三反应体系试剂，其中：

所述第一反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.2所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探针、SEQ ID NO.4所示序列的探针和SEQ IDNO.5所示序列的探针；

所述第二反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.7所示序列的扩增引物、如SEQ ID NO.8所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.9所示序列的探针、SEQ ID NO.10所示序列的探针和SEQID NO.11所示序列的探针；

所述第三反应体系试剂中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.2所示序列的扩增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探针和SEQ ID NO.6所示序列的探针；

第一反应体系试剂至第三反应体系试剂中，各个探针序列的5’和3’端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：同一反应体系试剂中的各个探针序列5’端的荧光基团各不相同，所述荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。

2.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述第三反应体系试剂中还包括：如SEQ ID NO.12所示序列的扩增引物、如SEQ ID NO.13所示序列的扩增引物和SEQ ID NO.14所示序列的探针。

3.根据权利要求2所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：SEQ ID NO.14所示序列的探针的5’和3’端分别与荧光基团和淬灭基团相连，其中：荧光基团选自：FAM、CY5或VIC。

4.根据权利要求1或3所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：各个探针序列的3’端包括MGB淬灭基团。

5.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：多重荧光定量PCR试剂盒中还包括：用于荧光定量PCR的其他试剂。

6.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：采用该多重荧光定量PCR试剂盒检测的方法包括以下步骤：1)提取样本中的DNA，将其作为DNA模板，DNA浓度不低于10ng/ul，DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0之间；2)将DNA模板分别加入第一反应体系试剂、第二反应体系试剂、第三反应体系试剂中；3)进行荧光定量PCR扩增反应；4)判断是否发生突变。

7.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述样本为血液样本或口腔上皮细胞样本。

8.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

步骤3)中荧光定量PCR扩增的反应体系为总体积为20μl如下体系：

9.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：步骤3)中PCR扩增的反应条件如下：

10.根据权利要求6所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：步骤4)中判断是否发生突变的方法包括以下步骤：

针对反应体系1中的结果判断：

R124H探针ct值35时，判断反应体系中没有R124H突变；R124L探针ct值35时，判断反应体系中没有R124L突变；如果R124H探针ct值≤35或R124L探针ct值≤35，按照以下方法进行判断：

(1)R124WT探针ct值-R124H探针ct值的差值＞4、R124L探针ct值-R124WT探针ct值＞5，则判断此样本为R124H纯合突变、R124L未突变样本；

(2)0≤R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值≤3.5、R124L探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124H杂合突变、R124L未突变样本；

(3)R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5、R124L探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124H未突变、R124L未突变样本；

(4)R124WT探针ct值-R124L探针ct值的差值＞4、R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124L纯合突变、R124H未突变型样本；

(5)0≤R124L探针ct值-R124WT探针ct值的差值≤3.5、R124H探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124L杂合突变、R124H未突变样本；

针对反应体系2中的结果判断：

R555Q探针ct值35时，判断反应体系中没有R555Q突变；R555W探针ct值35时，判断反应体系中没有R555W突变；如果R555Q探针ct值≤35或R555W探针ct值≤35，按照以下方法进行判断：

(1)R555WT探针ct值-R555Q探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R555Q纯合突变样本；

(2)-3≤R555Q探针ct值-R555WT探针ct值的差值≤3，则判断此样本为R555Q杂合突变样本；

(3)R555Q探针ct值-R555WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R555Q未突变样本；

(4)R555WT探针ct值-R555W探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R555W纯合突变样本；

(5)-3≤R555W探针ct值-R555WT探针ct值的差值≤3，则判断此样本为R555W杂合突变样本；

(6)R555W探针ct值-R555WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R555W未突变样本；

针对反应体系3中的结果判断：

R124C探针ct值35时，判断反应体系中没有R124C突变；如果R124C探针ct值≤35,按照以下方法进行判断：

(1)R124WT探针ct值-R124C探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124C纯合突变样本；

(2)0≤R124C探针ct值-R124WT探针ct值的差值≤3.5，则判断此样本为R124C杂合突变样本；

(3)R124C探针ct值-R124WT探针ct值的差值＞5，则判断此样本为R124C未突变样本。