[发明专利]检测Neofusicoccum algeriense的LAMP引物及试剂盒

权利要求书

1.用于检测蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组为：

外侧正向引物F3：5’-CCGGCAAGTCTATTGAGAACA-3’；

外侧反向引物B3：5’-CGGTTTGACGCTGTGGAA-3’；

内侧正向引物FIP：5’-CACATGGGCTTGGAGGGAATCACCCCAAGTTCATCAAGTCTGG-3’；

内侧反向引物BIP：5’-TGAGGCTTTCACCGAGTACCCCTGATTCAAGGTTCAAGGGAGG-3’。

2.含有权利要求1所述LAMP引物组的检测试剂或试剂盒。

3.蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述LAMP引物组，还包含dNTPs、BstDNA聚合酶、反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.权利要求1所述LAMP引物组、权利要求2所述检测试剂或试剂盒，或权利要求3所述检测试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense中的应用。

5.蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP扩增反应；

3）扩增结果判定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所用反应体系为：

模板DNA 2μl

10mM dNTPs 1.25μl

20μM引物FIP 0.2~0.8μl

20μM引物BIP 0.2~0.8μl

10μM引物F3 0.05~0.2μl

10μM引物B3 0.05~0.2μl

8U/μL Bst DNA聚合酶 1μl

10×反应缓冲液 12.5μl

ddH₂O补足至25μl；

其中，所述反应体系中引物FIP和BIP按等量加入，引物F3和B3按等量加入，且引物FIP、BIP与引物F3、B3的总质量比为8:1。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所用反应条件为：61~65℃ 50~90分钟。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3）采用如下①~③中的任一种方法进行扩增结果判定：

①荧光染色法：向扩增产物中加入染料SYBR GreenⅠ，进行显色反应，若反应体系由橙色变为绿色，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense；或者，在扩增反应前向反应体系中加入钙黄绿素，扩增反应结束后，在紫外灯照射下反应体系显示荧光绿色，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense；或者，在扩增反应前向反应体系中加入羟基萘酚蓝，扩增反应结束后，若反应体系由紫色变为天蓝色，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense；

②琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌Neofusicoccum algeriense；

③焦磷酸镁浊度检测法：通过肉眼观察反应后的浑浊情况来判断是否发生了LAMP扩增反应，或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，实现实时定量检测。