[发明专利]液相色谱串联质谱检测新型心血管疾病风险标志物的方法

权利要求书

1.一种使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪(LC-MS/MS)检测生物样本中氧化三甲胺(Trimethylamine Oxide,TMAO)、胆碱(Choline)、甜菜碱(Betaine)、肌酐(Creatinine)和左旋肉碱(L-Carnitine)含量的分析方法，它包括以下步骤：

(一)、标准溶液的配制

(a)、标准曲线的配制

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准品适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制标准品储备液。使用50％～90％甲醇水溶液稀释标准品储备液，配制混合标准品工作液；

使用50％～90％甲醇水溶液稀释混合标准品工作液，配制标准曲线，使其浓度范围分别为：TMAO 0.01-10μg/mL，Choline 0.1-100μg/mL，Betaine 100～10000.1-100μg/mL，Creatinine 0.1-100μg/mL，L-Carnitine 0.1-100μg/mL。

(b)、标准内标液的配制

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的内标适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制内标储备液；使用蛋白质沉淀剂稀释标准品储备液，配制混合内标工作液。使其浓度分别为：TMAO-d9 5～50ng/mL，Choline-d45～50ng/mL，Betaine-d3 50～500ng/mL，Creatinine-d3 5～50ng/mL，L-Carnitine-d3 5～50ng/mL；

(c)、质控品的配制

分析天平分别精确称取氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱标准品适量，用50％～90％甲醇水溶液溶解，配制质控品储备液；使用50％～90％甲醇水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液；

将10～20人份的生物样本混合，加入不超过生物样本总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)；每支30μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用；

(二)生物样本的处理

取待检血液至少1mL，在离心速度为1500～3000rpm下离心10～30min，得到上清液，置于-80℃备用；

(三)待测生物样本/标准曲线/质控品处理

移液器移取步骤(b)的混合内标工作液500～1000μL于1.5mL离心管中，然后加入10～50μL的生物样本/标准曲线/质控品于上述离心管中，混匀，在离心速度为13000～24000rpm下离心10～30min，去除蛋白质沉淀，移液器取上清供LC-MS/MS检测。

(四)待测样本的检测

使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对(三)中处理后的生物样本/标准曲线/质控品进行检测。通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测生物样本的峰面积计算出待测生物样本中的氧化三甲胺、胆碱、甜菜碱、肌酐和左旋肉碱的浓度。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：生物样本包括干血片、血清和血浆。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：在步骤(a)中使用5～9种不同浓度的标准曲线。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述内标分别为氘代同位素内标，具体为氧化三甲胺-d9(TMAO-d9)、胆碱-d4(Choline-d4)、甜菜碱-d3(Betaine-d3)、肌酐-d3(Creatinine-d3)和左旋肉碱-d3(L-Carnitine-d3)。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：使用蛋白质沉淀剂作为内标工作液溶剂，蛋白质沉淀剂包括甲醇/乙腈(100～0％-0～100％)。