[发明专利]一种烯酮还原酶与一种布瓦西坦中间体的制备方法

权利要求书

1.一种布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，其反应路线为：

并且，包括以下步骤：

S1：在吗啉的催化下，戊醛和乙醛酸反应生成5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；

S2：在硼氢化钠的催化下，5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮脱除羟基生成4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；

S3：在烯酮还原酶的存在下，4-正丙基-2(5H)-呋喃酮发生还原反应生成目标产物布瓦西坦中间体；

其中，所述烯酮还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述烯酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

其中，步骤S3包括：

向反应容器中加入4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体，附加酶湿菌体，辅酶循环反应底物，辅酶，以及缓冲液，搅拌反应完全，后处理，即得所述布瓦西坦中间体；

其中，附加酶湿菌体为酮还原酶湿菌体或葡萄糖脱氢酶湿菌体；

其中，辅酶循环反应底物为异丙醇或者葡萄糖；

并且，当使用酮还原酶湿菌体时，采用异丙醇作为辅酶循环反应的底物；当使用葡萄糖脱氢酶湿菌体时，采用葡萄糖作为辅酶循环反应的底物。

2.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：

向反应容器中依次加入蒸馏水、吗啉、乙醛酸以及戊醛，搅拌反应完全，后处理，即得5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；其中，吗啉、乙醛酸和戊醛的摩尔比为(101～107)：100：100。

3.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：

先向反应容器中加入无水甲醇和5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮，接着分批加入硼氢化钠，搅拌反应完全，后处理，即得4-正丙基-2(5H)-呋喃酮；其中，硼氢化钠和5-羟基-4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的摩尔比为(1.1～3.0)：1。

4.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+。

5.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为5～9，并且所述缓冲液选自以下任一种：柠檬酸缓冲液，Tric-HCl缓冲溶液，磷酸盐缓冲液，TEOA缓冲液。

6.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌湿菌体的制备步骤包括：

将已经用两种内切酶酶切的表达载体pET-28a与合成的所述烯酮还原酶的核苷酸序列用T4连接酶连接，过夜，将连接产物加入至含有大肠杆菌电感受态细胞的电转中，在电转仪上立即进行电击，然后立即转移到冰上，加入预热到37℃的肉汤琼脂培养基，进行混匀；转移混匀后的培养基至培养管，200转37℃培养1小时；在含有100微升每毫升的卡那霉素的肉汤琼脂平板上进行划线培养，37℃培养箱过夜培养16小时；次日，在接种平板上挑取一个单克隆接种到含有卡那霉素的培养基的三角烧瓶中，37℃培养箱过夜培养；从过夜培养物以1比100接种量转接至含有新鲜的含有相同抗性的培养基中，37℃培养，250转振荡培养至菌液在600纳米波长处的吸光值OD600值达0.6～0.8，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在30℃继续培养过夜；离心，弃上清，收集所述重组大肠杆菌湿菌体。

7.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，4-正丙基-2(5H)-呋喃酮的浓度范围是2g/L～50g/L，表达所述烯酮还原酶的重组大肠杆菌湿菌体的浓度范围是1g/L～50g/L，所述辅酶的浓度范围是0.2～1g/L。

8.根据权利要求1所述的布瓦西坦中间体的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶湿菌体的浓度范围是0.2g/L～10g/L，此时作为辅酶循环反应底物的异丙醇的体积浓度范围是5％～20％；所述葡萄糖脱氢酶湿菌体的浓度范围是0.5g/L～25g/L，此时作为辅酶循环反应底物葡萄糖的浓度范围是2.5g/L～125g/L。