[发明专利]基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法，通过试剂盒及配套的信号通路刺激剂、检测抗体，利用质谱流式检测技术，能够实现特异地、有效地、高通量地以及单细胞水平地检测细胞内信号通路激活水平，大大提高了样品检测的精度，极大程度地避免了传统检测手段可能存在的假阴性分析结果。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于质谱流式检测技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法。

技术背景

质谱流式检测技术是在单细胞水平上通过质谱仪检测稀有金属标记的抗体，对每一个细胞进行多参数、高通量地定性分析的技术。该技术较传统的流式细胞术，具有更多检测参数以及更高的信噪比的优势，是目前最先进的单细胞流式检测技术，在临床医学与生物研究领域里得到了越来越广泛的应用。

信号通路是指组织器官中的细胞受到外源分子或者内源变化刺激的条件下，该刺激信号从细胞质膜经细胞质传输到细胞核内，引起细胞响应该刺激发生特定生物学变化的过程。信号通路桥接细胞内、外环境之间的信息沟通，其异常变化将引起组织器官的细胞出现异常的生理功能，进而影响正常组织器官的稳态维持以及正常生理功能的行使，最终引发疾病。然而，组织器官内不同类型的细胞对同一刺激的响应是存在差异的，同一类型的不同细胞所处的微环境差异也会造成细胞接受刺激的水平存在差异。因此，在单细胞水平上检测组织器官的细胞在异常刺激作用下的信号通路变化，对揭示各类疾病在细胞水平上的起始、发生、发展与恶化等过程是如何发生的，具有极其重要的临床诊断、医药转化等应用价值。

然而，传统的流式细胞检测技术由于其受限的检测参数，应用于有限的临床组织样品中以单细胞水平检测信号通路变化受到了极大地制约。目前商用的信号通路检测手段主要包括流式细胞分析、蛋白印迹法等手段进行检测，仅能从样品整体水平上判断信号通路的变化，并不能揭示这一变化是来自样品整体的变化趋势还是样品内特定细胞类型的变化水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法，能够实现在单细胞水平上检测样品细胞中信号通路，以解决目前该技术在商业应用上的不足。

本发明的技术方案如下：

基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，包括LD液、FⅠ液、FⅡ液、B液、W液、P液、D液、BC1-BC10液；所述LD液包括194Pt、RPMI 1640基础培养基，所述FⅠ液包括固定与通透液，所述FⅡ液为甲醛和磷酸盐缓冲液，所述B液为含人免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、仓鼠免疫球蛋白、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液的用于流式细胞技术的封闭缓冲液，所述W液为通透缓冲液，所述P液为固定/通透液，所述D液包括191/193Ir、甲醛和磷酸盐缓冲液，所述BC1-BC10液为包括磷酸盐缓冲液以及Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110中的任两种组合的液体。

在生理或病理环境中，细胞内信号蛋白磷酸化修饰的表达水平是处于该蛋白磷酸激酶与磷酸酶协同动态调节的。对样品细胞进行磷酸化修饰的检测需要在生理状态或者特定刺激条件下模拟的病理状态条件下，将样品细胞在活细胞状态进行弱固定处理后进行。本技术方案可以实现样品细胞在活细胞状态下进行活细胞染色、根据需求选择是否对样品细胞进行特定细胞刺激后立即进行弱固定——即固定细胞状态的同时尽量减少固定对细胞表面蛋白的抗原表位的结构破坏作用，并根据需要确定确定所需检测的信号通路磷酸化蛋白并标记金属标签。

进一步的，LD液为1体积份RPMI 1640基础培养基、0.01体积份1mM 194Pt(201194，Fluidigm)。本文中除特殊说明外，体积份均以mL为计量单位。

进一步的，F I液为5×固定与通透液(201065，Fluidigm)。

进一步的，F II液为0.9-1.3体积份16wt％甲醛溶液、9体积份磷酸盐缓冲液。