[发明专利]一种液质联用测定血浆中氢氯噻嗪、氯沙坦及5-羧酸氯沙坦浓度的方法

权利要求书

1.一种液质联用测定血浆中氢氯噻嗪、氯沙坦及其活性羟酸代谢产物5-羧酸氯沙坦浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）血浆样品预处理：

取血浆样品，加入甲酸溶液酸化，加入内标混合溶液，加入乙酸乙酯萃取，高速离心，吸取上清液，氮气吹干，加入ACN溶液，得到待测样品；

采用液相色谱-质谱联用检测：

①液相色谱测定，条件为：色谱柱：色谱柱 GL Sciences Inc.，InertSustain AQ-C18HP,3μm，2.1×100 mm；色谱柱温：40℃；流动相A：含5mM乙酸铵、0.05%乙酸的水溶液；流动相B：100% ACN溶液；洗液：50%ACN溶液和100%ACN含0.1%的三氟乙酸；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为5uL，分析时间3.5min；

②质谱测定，条件为：离子源为电喷雾离子源，接口温度：300℃，DL温度：250℃，加热气流量：10.00 L/min，加热块温度：400℃，干燥器流量：10.00 L/min；负离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z296.05→m/269.15，其为氢氯噻嗪；和m/z421.15→m/z157.25，其为氯沙坦；和m/z435.15→m/z157.15，其为5-羧酸氯沙坦；

标准曲线制备：

用EDTA-K₂为抗凝剂的血浆将工作液稀释20倍，取150uL的血浆样品，再加入50.0uL的的氘代内标混合溶液，混合后加入600uL乙酸乙酯，涡旋混合10min，在4℃条件下2600 g离心10 min，取300μL上清液，于N₂下吹干，加入150μL 50%甲醇复溶，摇匀5 min，即得标准曲线样品；采用上述中的色谱和质谱条件对不同浓度的标样进行测定，绘制峰面积-浓度标准曲线，得到线性回归方程：

氯沙坦：f(x)=2.09423*x-0.00370339，R²=0.9984388；

氢氯噻嗪：f(x)=1.88987*x-0.00216372，R²=0.9989974；

羧酸氯沙坦：f(x)=2.94750*x-0.00458261，R²=0.9993292；

（4）血浆中氢氯噻嗪、氯沙坦及其活性羟酸代谢产物5-羧酸氯沙坦浓度的测定：

将待测血浆按步骤（1）样品制备的方法制备，取待测样品按步骤（2）采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录氢氯噻嗪、氯沙坦及其活性羟酸代谢产物5-羧酸氯沙坦浓度对应的峰面积，将氢氯噻嗪、氯沙坦及其5-羧酸氯沙坦浓度和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到所述待测血浆中氢氯噻嗪、氯沙坦及其5-羧酸氯沙坦的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中氢氯噻嗪、氯沙坦及其活性羟酸代谢产物5-羧酸氯沙坦浓度的方法，其特征在于：所述步骤（1）中血浆样品预处理为血浆以EDTA-K2为抗凝剂，以各自待测物的氘代化合物为内标，在100uL的血浆样品，加入50.0uL的的内标混合溶液，加入50.0μL 1.0%FA混合溶液，混合后加入600uL乙酸乙酯，涡旋混合10min，在4℃条件下2600g离心10 min，取300 μL上清，N₂下吹干，加入150.0μL 25%ACN复溶，摇匀5 min，得到待测样品。