[发明专利]一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用

权利要求书

1.一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶由如下方法制得：

(1)基因获得：

以草酸青霉(Penicillium oxalicum)CGMCC No.5302基因组(GenBank：AGIH00000000.1)为模板，用引物cbh1-U-F和cbh1-U-R扩增获得纤维素酶基因(cbh1)(GenBank:GQ844299.1)的启动子序列cbh1(U)，用引物cbh1-D-hphR-F和cbh1-D-R扩增获得纤维素酶基因(cbh1)编码区的下游序列cbh1(D)，用引物Cel7B-cbh1(U)R-F和Cel7B-hphF-R扩增获得基因片段cel7B(GenBank:EU339127.1)，用引物cel5B-F和cel5B-R扩增获得基因片段cel5B(GenBank:KJ 955479)；以里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a ATCC13631的cDNA(GenBank:AAIL00000000.2)为模板，用引物swo1-AgpdA(p)R-F和swo1-R扩增得到基因swo1(GenBank:AJ245918.1)；以质粒pAN7-1(GenBank:Z32698.1)为模板，用引物AgpdA(p)-ptrAR-F和AgpdA(p)-R扩增得到构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因编码基因(gpdA)的启动子AgpdA(p)(GenBank:Z32524.1)；以草酸青霉基因组为模板，用引物PgpdA(p)-F和PgpdA(p)-Cel5BF-R扩增得到构巢曲霉的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的启动子序列PgpdA(p)；以质粒pME2892为模板，用引物ptrA-Cel5BR-F和ptrA-R扩增得到抗吡啶硫胺素基因ptrA；以质粒pSilent-1(GeneBank：LT827033.1)为模板，用引物hph-F和hph-R扩增得到潮霉素抗性基因hph，用引物trpC-swo1R-F和trpC-R扩增得到基因trpC终止子，将上述基因片段进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化试剂盒纯化目的片段，备用；

其中，上述所用引物的核苷酸序列顺序如下；

cbh1-F：ATGAAGGGTTCCATCTCCTACC

cbh1-R：TTACAGGCACTGGGAGTAGTACTCG

cbh1-U-F：CTCACCACCAGACTGTCGTTTTC

cbh-U-R：TGTGATGGATTGGATCAAAGATC

Cel7B-cbh1(U)R-F：

GATCTTTGATCCAATCCATCACAATGTCTTTCACAAGGAGACAGTTCC

Cel7B-hphF-R：TTCAATATCAGTTAACGTCGCTTCGGATCCATATTCAATTGC

hph-F:CGACGTTAACTGATATTGAA

hph-R:CAACCCAGGGCTGGTGACGG

cbh1-D-hphR-F：CCGTCACCAGCCCTGGGTTGGTCTTGAGTGGTCGTCGAGGTC

cbh1-D-F：GTCTTGAGTGGTCGTCGAGGTC

cbh1-D-R：GTGGTTCGTACTGGGGACCTC

PgpdA(p)-F：ATTATTCATAGTTTCTCCGCCG

PgpdA(p)-Cel5BF-R：

GGCAAGAATCAAATCGTATCTCATTTTTGCGATTGTTTGAAGTGTTC

Cel5B-F：ATGAGATACGATTTGATTCTTGCC

Cel5B-R：TGAGATACGATTTGATTCTTGCC

ptrA-Cel5BR-F：

GCATGAACAAGAAAACAAGATCACTGGGCAATTGATTACGGGATC

ptrA-F：GGGCAATTGATTACGGGATC

ptrA-R：ATGGGGTGACGATGAGCCGC

AgpdA(p)-ptrAR-F：GCGGCTCATCGTCACCCCATAGTCAGACGGCGTAACCAAA

AgpdA(p)-F：AGTCAGACGGCGTAACCAAA

AgpdA(p)-R：GGTGATGTCTGCTCAAGCGG

swo1-AgpdA(p)R-F：

CCGCTTGAGCAGACATCACCATGGCTGGTAAGCTTATCCTCG

swo1-F：ATGGCTGGTAAGCTTATCCTCG

swo1-R：TCAATTCTGGCTAAACTGCACAC

trpC-swo1R-F：

GTGTGCAGTTTAGCCAGAATTGATGATTTAATAGCTCCATGTCAACAA

trpC-R：AACCCAGGGCTGGTGACG；

(2)表达盒构建：

将(1)获得的基因cbh1(U)，cel7B，筛选标记基因hph以及cbh1(D)利用Double-jointPCR方法，先将所述基因片段按照物质的量比为1:2:2:1的比例做融合PCR，再用引物cbh1(U)-F和cbh1(D)-R进行巣式PCR，对扩增片段进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收纯化目的片段，碱基长度为6815bp，命名为表达盒1，其基因型为Δcbh1::cbh1(U)-cel7B-hph；将(1)获得的基因PgpdA(p),cel5B,ptrA,AgpdA(p)，swo1和trpC终止子利用Double-joint PCR方法:(i)将PgpdA(p),cel5B,ptrA,片段按照物质的量比为1:2:1的比例通过融合PCR克隆片段，使用巣式引物PgpdA(p)-F和ptrA-R对融合片段进行克隆，对扩增片段进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收纯化目的片段PgpdA(p)-cel5B-ptrA，(ii)将AgpdA(p)，swo1，trpC终止子按照物质的量比为1:2:1的比例通过融合PCR克隆片段，使用巣式引物AgpdA(p)-ptrAR-F和trpC-R以融合PCR产物为模板做巣式PCR，对扩增片段进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收纯化目的片段AgpdA(p)-swo1-trpC，(iii)将片段PgpdA(p)-cel5B-ptrA和AgpdA(p)-swo1-trpC按照物质的量比为1:1通过融合PCR克隆片段，使用巣式引物PgpdA(p)-F和trpC-R以融合产物为模板进行巣式PCR，对扩增片段进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收纯化目的片段，碱基长度为8705bp，命名为表达盒2，其基因型为：PgpdA(p)-cel5B-ptrA-AgpdA(p)-swo1-trpC；

(3)工程菌株构建：

通过制备原生质体转化的方法，将(2)构建的表达盒1转入草酸青霉CGMCC No.5302原生质体中，将转化好的原生质体转入含有0.18mg/mL的潮霉素固体筛选平板上，30℃培养3～5天，挑取阳性转化子传代培养，同时以提取的阳性转化子基因组DNA为模板，以草酸青霉CGMCC No.5302的基因组DNA为阴性对照，用引物cbh1-F和cbh1-R进行检测，判定是否将基因cbh1的编码区敲除，用引物cbh1-U-F和hph-R，cel7B-F和cbh1-R，检测表达盒是否完整，筛选敲除基因cbh1编码区并且表达盒完整插入正确位置的重组菌株命名为菌株cE；

通过制备原生质体转化的方法，将(2)构建的表达盒2转入菌株cE的原生质体中，将转化好的原生质体转入含有0.4μg/mL吡啶硫胺素的固体筛选平板上，30℃培养3～5天，挑取阳性转化子传代培养，同时以提取的阳性转化子基因组DNA为模板，以草酸青霉CGMCCNo.5302的基因组DNA为阴性对照，用引物PgpdA(p)-F和swo1-R，PgpdA(p)-F和ptrA-R，ptrA-F和swo1-R检测表达盒是否完整插入到基因组上，选择表达盒整合成功的菌株命名为工程菌株cEES；

(4)发酵产酶：

取工程菌株cEES，经活化后获得种子液，无菌条件下，以重量百分比计，将菌丝按照0.3％～2％的比例加入发酵培养基中，在28～35℃，150～250rpm培养3～7天，或发酵罐培养3～7天；之后以10000rpm离心10min获得上清液，即为含纤维素酶发酵液；

其中：所述纤维素酶内切酶活力与外切酶活力的比值为40～60，内切纤维素酶Cel7B与Cel5B的蛋白比值为1～1.5。