[发明专利]利用TiO2

权利要求书

1.一种利用TiO₂-PGC芯片质谱法全面分析树鼩呼吸道组织糖链谱的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、收集树鼩呼吸道组织；

步骤二、将所述树鼩呼吸道组织裂解糖链；

步骤三、通过TiO₂-PGC芯片-Q-TOF-MS法定性分析N-糖链谱；

步骤四、通过唾液酸酶反应鉴定唾液酸连接键；

步骤五、通过TiO₂-PGC芯片-QQQ-MS法定量分析N-糖链谱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二如下进行：

1)将树鼩呼吸道组织剪成碎片后用RIPA溶解裂解，提取蛋白；

2)将提取出的蛋白使用进行离心过滤浓缩；测定每个样品的蛋白质浓度；各个样品取质量相等，每200μg蛋白用100mM的pH为7.4的碳酸氢铵稀释至1μg/μL；随后加入PNGase F，在37℃孵育16h，裂解得到N-糖链直接装载在预处理的C₁₈柱子上，再用蒸馏水溶解出来，合并流通液和溶解液，冷冻干燥，以100μL蒸馏水复溶冻干样品，4℃环境下14000rpm离心5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三如下进行：

将每份样品的中性N-糖链和酸性N-糖链分开为两个独立的进样；第一次进样，注入2μL的样品，通过加载缓冲液以3μL/min的流速转移到富集柱，该缓冲液由重量百分比为0.6％的甲酸、2％乙酸和2％乙腈溶于水组成；纳米泵的移动相分别由1％乙酸溶于水作为A相和乙腈作为B相组成；通过梯度溶液5％B相冲洗6min、5-60％B相冲洗10min、80％B相冲洗3min，将中性糖从分析柱上洗脱下来，流速为0.5μL/min；第二次进样，注入5μL的氨水，从分析柱洗脱酸性N-糖链的移动相由0.5％乙酸水溶液作为A相和1％乙酸-乙腈溶液作为B相组成，以5％B相1min、5-60％B相超过10min、80％B相3min梯度洗脱，没针以前的平衡时间为10min；

由Q-TOF MS得到N-糖链谱，干燥的N₂以11L/min和225℃的条件处理样品，MS和MS/MS谱分别通过质量范围为m/z 500-3000和m/z 100-3000正极模式获得，通过参考质量大小m/z922.0098进行质量校正，碰撞能量设为10-40eV。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四如下进行：

将2μL唾液酸酶与14μL的混合样品和4μL5×反应液混合成为20μL反应体系，在37℃孵育1h，然后进行质谱分析。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤五如下进行：

将每份样品的中性N-糖链和酸性N-糖链分开为两个独立的进样；第一次进样，注入2μL的样品，通过加载缓冲液以3μL/min的流速转移到富集柱，该缓冲液由重量百分比为0.6％的甲酸、2％乙酸和2％乙腈溶于水组成；纳米泵的移动相分别由1％乙酸溶于水作为A相和乙腈作为B相组成；通过梯度溶液5％B相冲洗6min、5-60％B相冲洗10min、80％B相冲洗3min，将中性糖从分析柱上洗脱下来，流速为0.5μL/min；第二次进样，注入5μL的氨水，从分析柱洗脱酸性N-糖链的移动相由0.5％乙酸水溶液作为A相和1％乙酸-乙腈溶液作为B相组成，以5％B相1min、5-60％B相超过10min、80％B相3min梯度洗脱，没针以前的平衡时间为10min；

由QQQ MS得到N-糖链谱，采用多反应监测法的正极模式，干燥的N₂以11L/min和225℃的条件处理样品，中性N-聚糖的停留时间设为10ms，而酸性N-糖链的则设为5ms，碎裂电压设为380V，而高压和低压离子漏斗的RF电压幅度分别为150和200V。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括数据处理与数据分析，该步骤中，通过计算机软件对质谱数据进行多变量数据分析，并将这些质谱数据与现有糖链数据库的数据进行对比，鉴定组织上表达的N-糖链的差异和表征。