[发明专利]一种隐孢子虫蛋白激酶660 C端蛋白的制备及其应用

权利要求书

1.一种隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以隐孢子虫基因组DNA为模板，SEQ ID NO：1～2所示序列为扩增引物，PCR扩增反应得到Cp660C基因片段；

S2.将S1所述将扩增得到的Cp660C基因片段与原核表达质粒双酶切，连接，得到Cp660C重组质粒；

S3.将S2的Cp660C重组质粒转入表达宿主菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，挑取阳性克隆菌，保存；

S4.将S3挑取的阳性克隆菌扩大培养，当菌体生长至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，16℃，180rpm，诱导12h；

S5.取S4诱导表达后的菌液，冷冻离心收集菌体，弃上清，清洗菌体后重悬，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂，冰浴超声裂解菌体，得裂解液，再低温离心取上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤；

S6.取步骤S5中过滤后上清液经Ni柱纯化，洗脱，收集目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增反应体系为：Phusion酶0.5μL，上游引物2.5μL，下游引物2.5μL，DNA模板1μL，2mM dNTPs 5μL，5xPhusion HF buffer 10μL，ddH₂O 28.5μL，一共50μL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸35s，35个循环；最后72℃延伸7min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述原核表达质粒为pET-28a质粒。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5具体为4℃离心收集菌体，8000rpm离心10min，弃上清；用25mL PBS清洗菌体，反复清洗3～5次；每100mL菌液加10mlPBS重悬菌体，以1:50～1:200比例添加蛋白酶抑制剂；超声裂解菌体，工作效率为45％，工作时长2s，暂停时长4s，共时长40～60min，过程在冰浴中进行；裂解后的菌液4℃离心，8000rpm，10min，收集上清，并用0.45μm的滤膜进行过滤。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述Ni柱在加入蛋白样品前先加入5倍柱体积无离子水将填料中的20％乙醇洗涤干净；再用5倍柱体积pH＝8.0结合缓冲液平衡Ni柱。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱为将蛋白样品加入Ni柱中，使之与树脂混合均匀，冰上孵育20min；将样品反复上柱3次，样品与Ni柱结合完全后，依次用5倍柱体积的结合缓冲液、20mM咪唑溶液、40mM咪唑溶液、80mM咪唑溶液和100mM咪唑溶液进行充分洗脱杂蛋白，最后用5倍柱体积的200mM咪唑溶液收集目的蛋白。

8.权利要求1～7任一所述的隐孢子虫蛋白激酶660C端蛋白的制备方法在蛋白激酶660功能验证中的应用。