[发明专利]一条HLA-A2限制性肿瘤相关抗原E蛋白的抗肿瘤优势CTL表位肽及应用

说明书

一条来源于肿瘤相关抗原E蛋白的抗肿瘤优势CTL表位肽，为HLA‑A2限制性抗肿瘤CTL表位肽，能被DC内吞后以肽‑MHC‑I类复合物形式呈递出来，为十四肽，其序列为：VGYAAPPSPPLSR；所述的抗肿瘤优势CTL表位肽，为具有该氨基酸序列的游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述为单体的各种形式的聚合体。本发明的能被DC内吞后以肽‑MHC‑I类复合物形式呈递出来特异性诱导CTL的优势表位肽体外容易合成，能够诱导特异性CTL分泌一定的IFN‑γ，并对HLA‑A*0201和E蛋白表达阳性的BT‑549和MDA‑MB‑231细胞产生一定的抗原特异性杀伤效应，制成的E蛋白表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，能够诱导产生显著抗肿瘤免疫反应，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域的多肽技术领域，具体涉及一种E蛋白来源的抗肿瘤CTL优势表位肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是新世纪人类的第一杀手。手术、放疗及化疗等传统治疗方法对某些肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗效果尚不理想。目前细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Tlymphocyte，CTL）在抑制肿瘤中的作用受到极大重视，如何有效激发 CTL 介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。CD8⁺T细胞所识别的抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位肽，因此，研究开发一种抗肿瘤CTL优势表位肽是目前亟待解决的新课题。

发明内容

肿瘤抗原的发现及其CTL表位肽的鉴定是肿瘤特异性免疫治疗以及肿瘤治疗性多肽疫苗研制的重要前提。本发明目的在于找到有效激发 CTL 介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能的CTL优势表位肽。细胞外基质蛋白-1在多种肿瘤细胞中显著高表达，且与多种肿瘤的发生和迁移显著相关，是肿瘤诊断和抗肿瘤治疗中有潜力的靶点。本发明通过高通量筛选和鉴定，精准筛选得到能够被DC内吞后以肽-MHC-I类分子复合物形式呈递在表面的CTL表位肽，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的表位肽，从而有效杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的，以及所述表位肽在制备用于临床治疗和检测肿瘤性疾病疫苗中的用途；免疫原性弱和免疫耐受极大地限制了天然 CTL 表位在肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用，因此，有效提高天然 CTL 表位的免疫原性并打破机体的免疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对天然 CTL 表位进行分子改造被认为是最行之有效的方法之一。由于 CTL 表位与主要组织相容性复合体 (MHC)- I类分子的结合是诱导 CTL 免疫应答的关键因素，而CTL表位与 MHC- I类分子结合的重要基础是锚定残基，因此，可通过改变锚定残基或其相邻位置的氨基酸残基以达到增强免疫原性而不影响特异性的目的。本发明提供一种肿瘤相关抗原E蛋白来源的MHC-I 限制性CTL表位，该表位能够被DC内吞后以高亲和力结合MHC-I类分子，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的 CTL 免疫应答，表现为刺激肽特异性CTL 分泌高水平的 IFN-γ 并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应；该肿瘤相关抗原优势表位肽为十三肽，其氨基酸序列为：VGYAAPPSPPLS所述的能够被DC内吞后以肽-MHC-I类复合物形式呈递在DC表面限制性靶向抗肿瘤CTL优势表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或真核细胞表达出纯化获得；所述的抗肿瘤CTL优势表位肽根据表位肽与人HLA-A2分子相互作用机理，并根据其能有效与HLA-A2分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度为13个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用；本发明的要点在于提供能与人HLA-A2类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的表位肽。其基本原理是：利用生物信息学分析E蛋白在多种肿瘤细胞中表达，利用E蛋白全蛋白表达序列筛选E蛋白表位肽，验证表位肽与人HLA-A2分子的理论结合能力，并通过T2亲和力实验进一步验证表位肽与HLA-A2分子的结合力；然后通过Fmoc固相合成法合成、HPLC纯化表位肽，并通过HPLC-MS分析其纯度和分子量；最终利用DC负载表位肽诱导CTL细胞，并通过与MHC-I类分子表型的肿瘤靶细胞混合培养，观察CTL细胞免疫杀伤靶细胞的HLA-A2分子的限定性；本发明的有益效果在于:本发明公开了来源于肿瘤相关抗原的天然 CTL 优势表位肽，该 CTL优势表位能够肽能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为可刺激肽特异性CTL分泌高水平IFN-γ 并对该表位肽来源蛋白阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤效应，在肿瘤免疫治疗领域具有很好的应用前景。